牛病毒性腹泻病毒rt-pcr方法建立和gp48基因克隆及原核表达

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1、摘要牛病毒性腹泻．粘膜病(BVD．MD)，是由牛病毒性腹泻病毒引起的一种发热、粘膜糜烂、溃疡、腹泻、白细胞减少、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的传染病。由于其能引起母牛繁殖系统障碍并能形成持续性感染，因而对养牛业有着重要的影响。本试验用MDBK细胞增殖BVDVOregonC24v，在细胞出现80％病变时，收获细胞病毒培养液。对标准毒株OregonC24V进行TCID50的测定，测得TCID50为10i52。依据Ge重lBank中己发表的OregonC24V(AF091605)，NADL(M3118)，ZM95(AF526381)，Singer(DQ088

2、995)等13株BVDV全基因序列进行比对，使用Primer5．0软件设计一对扩增引物，在扩增标准毒株OregonC24V得到了大小为330bp的片段，与预期设想一致。对CSFV，IBRV，BRV，PRV，PRRSV，MDBK细胞进行RT．PCR扩增，都未扩增出片段，表明此方法具有较高的特异性。对BVDV的TCID50倍比稀释后进行检测，稀释106倍仍能检测到病毒，表明此方法具有较高的敏感性。对临床采集的70份犊牛腹泻的粪便样品进行检测，有17份检测为阳性，阳性率为24．28％。表明此方法可用于BVDV实验室检测。以上结果证明该方法具有较高的实用价值，可为BVDV的

3、实验室快速诊断提供一个有效的方法。本试验依据GenBank中己发表的BVDV全基因序列进行比对，使用Primer5．0软件针对妒48全基因设计一对扩增引物，应用RT．PCR扩增技术对BVDVC24V株进行扩增并进行克隆及酶切鉴定，构建了pMDl8一T—gP48载体。将克隆载体进行测序，经序列对比与发表序列一致，表明成功构建了pMDl8．T．gP48载体。试验将妒48基因插入到pET32a(+)质粒，构建了原核表达载体。将构建好的原核表达载体进行酶切鉴定。SDS．PAGE进行检测分析，在46kDa左右处有蛋白条带。将表达蛋白纯化后进行Western．Blotting分

4、析，在46kDa左右处有特异性免疫印迹条带。结果表明gP48基因蛋白在原核表达载体中得到表达，而且能被BVDV阳性血清所识别。证明成功构建了PET32a(+)原核表达载体，为进一步建立检测BVDV的ELISA方法奠定基础。关键词：BVDV；RT．PCR；克隆；原核表达；EstablishmentandapplicationofRT-PCRforBVDVandGeneCloningExpressionofgp48inProkaryoticCandidate：LiNingSpecialty：PreventiveVeterinaryMedicineAdvisor：SunJ

5、iguoAbstractBovineviraldiarrhoea-mucosaldisease(BVD—MD)，iscomposedofbovineviraldiarrheavirusbyafever,mucosalerosion，ulcer,diarrhea,leukopenia,coughandapregnantCOWabortionoroutputmalformationfetusasthemainfeaturesofinfectiousdiseases．BecauseitCancausetheCOWreproductivesystemdisordersand

6、canformapersistentinfection，SOthecattleindustryhasanimportantinfluenceon．Inthisexperiment，theproliferationofMDBKcellsofBVDVOregonC24Vcell，in80％lesions，cellharvestingviralcultureliquid．OnthestandardstrainOregonC24VTCID50weremeasured，themeasuredTCID50105-52．011thebasisofGenBankpublishedi

7、nOregonC24V(AF091605)，NADL(M3118)，ZM95(AF526381)，Singer(DQ088995)，13strainsofBVDVgenesequencealignment，usingPrimer5softwaretodesignapairofprimersforamplification，instandardstrainOregonC24Vgotbigsmallfor330BPfragments，andtheexpectedtentativeagreement．OnCSFV,IBRV,BTV,PRV,PRRSV,MDBKcell