基因克隆原核表达-2002

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基因的克隆与表达山东大学医学院免疫学研究所马春红 基因克隆(geneclonging)基因表达(geneexpression)-原核基因表达-真核基因表达 基因克隆GeneCloning 概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程 一、概述 1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件：限制性内切酶连接酶载体受体细胞 基因克隆（分子克隆molecullarcloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 基因克隆的核心-----体外重组(Recombination):人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 基因克隆的技术路线目的基因载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA 二、克隆载体 三、受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA无特异的内源性核酸内切酶载体复制、扩增不受阻与载体有互补性 四、体外重组的策略1、粘末端连接1）全同源粘末端连接最方便简单高背景-载体自身环化双向插入 2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略粘-粘连接：最有效、最快捷粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平 2、平末端连接：酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA效率低，酶用量大 3、人工接头连接人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段 4、T-A克隆T-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中，增加延伸时间，Taq酶可在产物的3’端多加一个A 五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得1、直接分离3、构建cDNA文库4、PCR5、人工合成6、差异显示 1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库 2、构建基因组文库，筛选目的基因基因组文库(genelibrary)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。 构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法） 特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况 3、构建cDNA文库，筛选目的基因cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选 4、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法 5、人工合成较短的DNA6、差异显示法(differentialdisplay,DD)—筛选差异表达的基因 （二）体外重组连接体系的建立：温度：粘末端连接：12-18℃平末端连接：室温（低于30℃)DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3酶量：平端连接时需加大酶量 （三）转化—Cacl2法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）原位杂交2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR方向鉴定：联合酶切测序 原核基因表达系统 一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。 据受体细胞的不同可分为：1．原核表达载体系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 二．原核生物基因结构和表达特点 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 多顺反子mRNA（polycistronicmRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。包括：调控区(调节基因，启动基因，操作基因)、结构基因： 5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子终止子 启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。一般长40-60bp，富含A-T硷基对共有保守序列：-10区（pribnowbox）：TATAAT-35区： RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录各种启动子启动转录能力不同。启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 富含GC的反向重复序列富含AT的序列转录形成发夹式结构 6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点转译起始密码子AUGSD顺序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp长约3-9bpmRNA与30s核糖体亚基间的识别与结合序列 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和5’非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 2、基因剂量：3、核糖体结合位点：SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。AUG—SD间距离。AUG后的核苷酸 四．原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子SD顺序筛选标志其它调控基因 类型：融合型表达载体：----融合蛋白非融合型表达载体：---天然完整蛋白分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 （一）融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因 1、主要元件：强启动子SD原核基因3’端 2、技术关键：克隆基因插入原核序列近3’端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点：加人工合成的DNA接头构建位相载体 ----ATG----AACCTGGAATTCCTAGGT-------TAC-----TTGGACCTTAAGGATCCA---EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA载体部分序列DNA序列 位相载体----含有3种读码框的系列载体 3、优点：表达效率高产物稳定易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性 Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子位相载体融合型载体----pGEX系列 （二）非融合型表达载体PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因 主要元件：强启动子SD：ATG：第一个密码子 非融合型表达载体----pPL-LamdaPL启动子---温度诱导插入位点--HpaI （三）分泌型表达载体：1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。 分泌型表达载体----pINIII-ompA1 分泌型融合表达载体----pEZZ18 五．提高表达水平的手段1、选择合适载体强启动子----提高转录水平核糖体结合位点（ATG---SD）避免产物降解：分泌/融合表达细菌蛋白酶抑制剂 2、选择合适宿主Lac启动子----LacI菌PL/PR--------CI857溶源菌 3、诱导表达温度诱导------PL/PRIPTG的化学诱导----Plac、Ptac 六．表达产物的检测：1、特异性鉴定：荧光抗体法免疫沉淀法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定