单克隆抗体及应用ppt课件

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1、单克隆抗体及应用(monoclonalantibody,McAbormAb)一.概述克隆：无性繁殖的细胞株单克隆：由一个细胞无性繁殖而来的一个细胞株（一团细胞），其中所有细胞特性完全一样（一）单克隆抗体：针对Ag分子表面某一抗原决定簇（又称表位）而产生的抗体分子，称McAb。单克隆抗体——由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体。（二）产生1.1975年KohlerandMilstein首创用杂交瘤技术成功制备McAb2.80年代初用基因工程成功制备McAb（三）制备McAb的方法1.杂交瘤技术2.基因工程技术二.杂交瘤技

2、术制备单克隆抗体1.B细胞(浆细胞）特点：1)能产生抗体2)但不能在体外长期培养3)细胞内含HGPRT酶（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶）和TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶），可通过旁路途径合成DNA2.骨髓瘤细胞1)能在体外长期培养2)不含HGPRT和TK酶3.杂交瘤细胞具有以上两种细胞的共性：既能产生抗体、在体外能长期培养；同时含有HGPRT和TK酶，可通过旁路途径合成DNA4.HAT培养液筛选出杂交瘤细胞(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）：氨基蝶呤是抗代谢的药物，能阻断内源性合成DNA（合成DNA的主要途径）。那么，HAT培养液是如何选

3、出杂交瘤细胞呢氨甲蝶呤（叶酸拮抗剂）阻止合成DNA杂交瘤细胞（含HGPRT、TK)经旁路途径合成DNA主要途径B细胞、瘤细胞杂交后，经HAT培养液培养数日后，五种细胞的存活情况：（1）B细胞：自然死亡（不能在体外长期培养）（2）瘤细胞：HAT培养液（氨甲蝶呤）阻止细胞合成DNA；同时无HGPRT、TK酶，不能通过旁路途径合成DNA，故死亡（3）B/B杂交细胞：自然死亡[同（1）]（4）瘤/瘤杂交细胞：死亡[同（2）]（5）浆细胞/瘤细胞杂交瘤细胞：可以生长HAT培养液中氨甲蝶呤阻止DNA合成；但其含有HGPRT、TK酶，可通过旁路

4、途径合成DNA（二）杂交瘤技术制备McAb的简要步骤1.制备能产生单抗的杂交瘤细胞2.克隆化杂交瘤细胞3.筛选杂交瘤细胞4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞5.收集单抗并鉴定6.纯化单抗1.制备杂交瘤细胞（1）制备能产生McAb的小鼠脾（B）细胞:Ag免疫Balb/c小鼠测抗体取脾制备脾细胞悬液计数（2）细胞融合：脾细胞（B)＋小鼠骨髓瘤细胞→杂交脾细胞(1-5×107/ml):瘤细胞（107-8/ml)融合剂：40%聚乙二醇（PEG)(3)筛选：培养过程中加入HAT培养液，培养14天，存活细胞为杂交瘤细胞。2.鉴定：将筛选出的能产生所需

5、抗体的杂交瘤细胞进行鉴定：方法：检测杂交瘤细胞培养的上清液中有无目的Ab，常用ELISA、IF间接法包被已知Ag＋杂交瘤细胞培养上清（Ab？）→洗涤，＋酶标羊抗鼠IgG→洗涤，＋底物→根据显色判断有无特异Ab3.克隆化（1）有限稀释法：特异性杂交瘤细胞稀释：7-10个/ml,取0.1ml/孔，反复稀释培养、经ELASA间接法筛选、检测特异抗体（2）显微操作法：直接在显微镜下取单个杂交瘤细胞培养、测特异抗体※筛选和克隆化应反复交叉进行。4.冻存或扩大培养（1）在液氮中冻存鉴定后的杂交瘤细胞备用，需要时复苏（2）扩大培养（增殖），可得

6、到大量单克隆抗体体外法：将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中进行培养、传代体内法：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内，利用它具有瘤细胞的特点能大量繁殖，产生腹水，腹水中有大量的单抗5.鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定单克隆抗体的纯度；（2）用ELISA、免疫电泳法鉴定抗体特异性6.纯化盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和层析法任选1-2种Ag免疫动物ELISA间接法测定抗血清分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合HAT筛选杂交瘤细胞选出产生单抗的杂交瘤细胞反复克隆化、筛选选出能产生单抗的单克隆杂交瘤细胞株细胞冻存扩大培养单抗分离提纯杂交瘤技术制备单克

7、隆抗体流程（三）杂交瘤技术制单抗的优缺点优点：1.制备的单抗特异性高、效价高、产量高缺点：1.需特殊条件、无菌操作、难得到稳定细胞株；2.抗体为抗鼠的IgG抗体，长期用于人体不利三.人源单克隆抗体（一）概念：单克隆抗体为人IgG（二）制备目的：用于人（三）杂交瘤技术制人源单抗的方法1.人B细胞+鼠瘤细胞杂交后不稳定2.人B细胞+人瘤细胞大多人瘤细胞含有HGPRT酶3.人B细胞+人淋巴母细胞样细胞恶性、难以获得4.EBV转化能产生Ab的B细胞转化过程复杂四.基因工程制备单克隆抗体（一）概念：在基因水平上对编码抗体的基因进行切割、拼接

8、或修饰，甚至人工合成，然后导入受体细胞内表达而产生的抗体（单克隆抗体）。人-鼠嵌合抗体(chimericantibody)重构抗体(reshapedhumanizedantibody)小分子抗体:Fab片段Fc片段Fv片段双特异性抗体(bispec