单克隆抗体ppt课件.ppt

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1、单克隆抗体Monoclonalantibody单克隆抗体单克隆抗体的定义单克隆抗体的原理单克隆抗体的特点单克隆抗体的制备流程单克隆抗体（McAb)单克隆抗体的定义Epitope,Antigenicdeterminant抗原决定簇●一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇●每个抗原决定簇至少诱生一种专一性抗体●蛋白质抗原决定簇含有六个以上氨基酸●一个B细胞只能生产一种抗体，对付某一抗原决定簇。●若有许多抗原决定簇，则需许多株B细胞分別生产许多抗体。BBBYYYY抗原BYB亲和力成熟11Y22Y33Y44抗原决

2、定簇表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的结构与功能完全相同的同源抗体。单克隆抗体的定义MONOCLONALANTIBODYMONO单个细胞CLONE无性繁殖ANTIBODY抗体单克隆抗体（McAb)单克隆抗体的原理AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.581234mmmm12341234单克隆抗体细胞融合取出脾细胞+癌细胞各抗体分开x传统抗血清抗原免疫所有抗体混合1

3、23412341234B细胞抗原免疫小鼠后，其脾脏会产生分泌抗体的各种B细胞。每种B细胞只能分泌一种抗体，对抗各自的抗原决定基。传统抗血清便是所有抗体的混合，得以有效保护动物个体。假如能够把单一个B细胞挑出来培养，则可收获单一种抗体。但是，B细胞无法在试管中培养生长。癌细胞可以在试管中持续培养生长，但无法产生所要的抗体。这些单独的融合细胞可以大量生产单独一种抗体，就是单克隆抗体。若把B细胞与癌细胞融合，所得到的融合细胞则可分別培养。骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术仙台病毒聚乙二醇（PEG）

4、电融合杂交瘤技术的理论基础聚乙二醇（PEG）融合率高出仙台病毒数百倍。目前实验室制备杂交瘤最常用的融合剂。作用机制：PEG的亲水性使细胞表面极性降低，导致脂双层不稳定而造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。小分子PEG(1000～4000)最常用，浓度：30%～50%。骨髓瘤细胞脾细胞PEG杂交瘤细胞融合后细胞的类型:杂交瘤技术的理论基础融合细胞筛选技术DNA合成的途径糖+氨基酸TK胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)核苷酸前体次黄嘌呤HGPRTIMP(Hypoxanthi

5、ne,H)核苷酸DNA叶酸HGPRT:次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶TK:胸腺嘧啶核苷激酶主要途径补救途径融合细胞筛选技术生化代谢缺陷型骨髓瘤细胞系次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷株胸腺嘧啶核苷激酶（TK）缺陷的细胞株单克隆抗体产生的原理HAT培养基根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞的特殊培养液。H：次黄嘌呤A：氨基蝶呤T：胸腺嘧啶糖+氨基酸氨基喋呤(Aminopterin,A)TK胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)核苷酸前体次黄嘌呤HGP

6、RTIMP(Hypoxanthine,H)核苷酸DNA叶酸H：次黄嘌呤A：氨基蝶呤T：胸腺嘧啶HAT选择培养原理融合后细胞在HAT培养基中存活情况HGPRT+,TK+不能长期生长死亡HGPRT+,TK+能够长期生长生长繁殖死亡HGPRT－,TK－能够长期生长随机融合后的细胞类型细胞组合HGPRT生长状态淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤+骨髓瘤-不能生长未融合淋巴细胞+短期生长未融合骨髓瘤-不能生长杂交瘤细胞的筛选脾细胞骨髓瘤细胞细胞融合HAT初步筛选ELISA筛选阳性克隆单

7、克隆抗体产生的原理可生产有用抗体的淋巴细胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体杂交瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生长产生专一性抗体一个Bcell只产生一种抗体HAT选择培养原理核苷酸从头合成途径（denovosynthesis）核苷酸补救合成途径（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）融合后细胞在HAT培养基中存活情况无法培养HAT

8、中死亡单克隆抗体产生的原理单克隆抗体（McAb)单克隆抗体的特点单克隆抗体的特性高特异性针对一个抗原决定簇高度的均一性和可重复性单个细胞株产生，分泌均一抗体生物功能局限不呈现沉淀反应抗单一抗原决定簇不易形成三维晶格结构单克隆抗体的特性细胞毒作用较弱对细胞的凝集作用弱对环境敏感易受环境的pH、温度、盐类浓度的影响反应强度弱，特异性好免疫酶分析、免疫荧光分析、放射免疫分析、ELISA单克隆抗体与单克隆抗体的比较常规免疫血清抗体McAb抗体产生细胞多克隆性单克