叶绿体分离及荧光染色观察

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1、叶绿体的分离及荧光染色观察泮力菁2011级生物基地201100140091同组者：商倩倩【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光；3、复习巩固制片及染色的基本技术。【实验原理】1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。2、差速离心和密度梯度离心：差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。在差速离心

2、中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。最后为核糖核蛋白复合体。由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同

3、的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。3、荧光：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随

4、之立即消失。荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。1、荧光显微镜及其操作的注意事项：激发光源启动后，15min之内不得关闭电源，一旦关闭电源，3min内不得重新启动；光路对中；选择相对应的激发滤片，阻断滤片和双色滤片；需照片时，应该及时

5、拍照，否则效果可能会降低。激发滤片：得到想要的激发光；双色镜：三角棱镜。起分离激发光和荧光的作用；阻断滤片：阻挡未转化成荧光的激发光，三者组合成为激发滤块；荧光显微镜的物镜与标本离得较近，用于多收集荧光；2、染色剂吖啶橙：A、探针特性：AO是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光；AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核苷酸的磷酸发生静电间相互作用。强结合作用又称插入性方式。AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插入后的探针分子与

6、核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构就发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子插入的数目，每隔三个碱基插入一个AO分子，这种方式的结合，主要是AO分子与DNA结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸和结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA结合，其发射波长为640nm呈红色荧光。AO愈合素昂的结合在低浓度下最佳，此时插入性强结合作用方式占优势。B、AO的主要应用：对细胞内单链或双链DNA/RNA定性或定量测定；分析核酸内部结构及核酸的细

7、胞成分构象；观察DNA凝胶电泳情况；作为细胞内PH梯度的显示剂，用来检测离子交换，钙离子诱导的质子浓度梯度变化等。【实验器材】1、材料：新鲜菠菜；2、试剂：吖啶橙染色剂；0.35mol/L的NaCl溶液；3、实验器材：普通或高速离心机；电子天平；荧光显微镜；剪刀；滴管；离心管；盖玻片，载玻片；镊子；普通显微镜等；【实验步骤】1、选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦干，称30克放于150ml0.35M.Nacl溶液中；2、将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3–5分钟，