叶绿体的荧光染色和观察

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时间:2019-06-12

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1、【实验题目】叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过对植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。 2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光3、熟悉荧光显微镜的使用方法。【实验材料与用品】1. 器材:离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管六层纱布,载玻片、盖玻片等 2. 材料:新鲜菠菜3.试剂:0.35 mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(acridine orange)【实验原理】I.叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞:利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒,收集类叶绿体大小的颗粒,得到叶绿体。差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小

2、、形状和密度,也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中,同一时间内,密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。依次增加离心力和离心时间,就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部,分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液中进行(0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液),以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃条件下进行:如果在室温下,要迅速分离和观察。II.差速离心特点:介质密度均一,速度由高到低,逐级离心;用途:分离大小相差悬殊的细胞和细胞器;沉降顺序:核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内

3、质网与高尔基体---核蛋白体,可将细胞器初步分离,常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。III.荧光的概念光致发光:某些物质在照射下,吸收光能进入激发态,当从激发态回到基态时,可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能,这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光,如磷光和荧光。荧光:在光致发光中,如果一定波长的短波光(如紫外光)照射某种物质,这种物质吸收光能后进入激发态,并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光(如可见光),这种光就称为荧光,一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光(次生荧光、续发荧光、间接荧光)。某

4、些物质受激发光照射后可直接发出荧光,如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等,称为自发荧光(直接荧光),某些物质本身不发荧光,但它经荧光染料染色后,再通过紫外线照射同样也能发出荧光,这样的荧光称为诱发荧光,如叶绿体被吖啶橙染色后可发出桔红色荧光。荧光的性质1)吸收光,必须有激发光源2)荧光波长>激发波长(损失热能)3)荧光强度极小于激发光的强度4)有不同程度的衰减(影响因素:如温度、光、淬灭剂等;先拍照后观察)5)荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率(在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油)吖啶橙(AO)1)探针特性:吖啶橙是三环杂芳香类荧光探针

5、,既可以标记DNA,又可以标记RNA,用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。2)AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种:一种是嵌入核酸双链的碱基对之间,另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。3)强结合方式:又称插入性方式,AO分子插入在核酸双链的碱基对之间,它们的结合能量为6-10kcal/mol探针,插入后的探针分子与核酸结合的更加稳定。每插入一个AO分子,双链结构就发生26度旋转,这样在一个位点上就限制了AO分子的插入数目,每隔三个碱基插入一个AO分子。这种方式的结合,主要是AO分子与DNA的结合,其荧光发射峰为530nm,呈绿色荧光。4)弱结合方式:即静电吸引结合方

6、式,带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合,每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子,最大结合率为1:1.这种结合方式主要是AO分子与RNA的结合,其发射波长为640nm,呈红色荧光。1)AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳,此时插入性强结合方式占优势。④AO的主要作用1)对细胞内单链或双链RNA或DNA定性和定量2)分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象3)观察DNA凝胶电泳情况4)作为胞内PH梯度显示剂,用来监测钠离子交换、钙离子诱导的质子梯度变化等。IV.荧光显微镜的操作及注意事项 1) 接通电源,打开启动装置开关 ; 2) 按starter按钮3-5秒以启动激发光源。注意sta

7、rter键不能超过5秒。启动2-3分钟后方可稳定,启动15分钟内不得关闭电源,一旦关闭汞灯,3分钟内不得重启,用完后关闭main switch; 3) 光路对中(换灯泡时进行);4)选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。5)放置样品,先在普通光镜下选择好要观察的视野; 6) 关闭普通光源后,撤开UV挡板,即可观察到样品的萤光情况7)需要照相时,要及时拍照,否则可能拍不到萤光照片; 8) 观察结束后,关闭mainswitch,切断电源。【实验步骤】一、具体

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