乙型肝炎病毒全长基因的扩增

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1、乙型肝炎病毒全长基因的扩增摘要:目的为从全基因水平研究乙型肝炎病毒变异与致病性的关系，建立从血清及质粒标本经聚合酶链反应（PCR）扩增HBV全长基因的新方法，并初步进行克隆分析.方法设计了含SalⅠ，SapⅠ酶切位点的引物，扩增3200kbHBV全长DNA，经酶切及连接后克隆入载体.结果用新建立的方法直接从少量血清中获得了全长HBV基因以及HBV全基因克隆.结论该法可用于对HBV毒株的基因结构和功能的研究.　　0引言　　自PCR技术问世以来，对HBV基因组主要功能区的扩增均已成功，并应用于临床诊断和基

2、础研究.但多数研究仅能限于对某一基因片段的研究，通过PCR扩增个体内HBV基因群中的某些亚基因片段，然后直接测序.由于HBV基因突变的复杂性，仅亚基因片段的研究是无法使出现在单个基因分子上的点突变与致病和传播的关系得到精确和全面的分析的［1］.我们根据Gunther等［2］的报道，并加以改进后，建立了一种HBV全长聚合酶链反应（Full-lengthPCR），可以直接从少量血清中一次克隆HBV全基因，为研究HBV毒株的基因结构与功能提供了新的方法.　　1材料和方法　　1.1材料标本收集10份乙型肝炎患

3、者血清收集自西京医院检验科2000-01/2000-06的临床标本，HBV检测阳性.主要试剂和设备ExpandHighFidelityassay购自德国BMI公司、DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均为美国Promega公司产品.SalⅠ，BglⅡ，HincⅡ限制性内切酶和T4连接酶购自华美公司.蛋白酶K购自Merck公司.HBVDNA检测试剂盒为华美公司产品，其引物针对S基因区，扩增片段长度为580bp.PCP10HBVDNA全基因质粒由解放军302医院惠赠.PE-480扩增仪购自美国PE公司.　　1

4、.2方法　　1.2.1血清HBVDNA提取200μL血清与蛋白酶K裂解液1∶1混合（终浓度为20mmol・L-1Tris-HCl，pH8.0，10mmol・L-1EDTA，100mL・L-1SDS，0.8g・L-1蛋白酶K）.65℃4h，99℃15min，离心后取上清，常规酚/氯仿抽提2次，无水乙醇沉淀，750mL・L-1乙醇洗涤干燥后，DNA溶于20μL双蒸水中.　　1.2.2引物设计HBV全长DNA扩增技术的关键首先是引物的选择

5、，Gunther等发现，如果延伸越过整个HBV基因序列中的两个缺口区，与扩增连续的基因片段相比，效率约降低1000倍.因此，我们选择了位于整个HBV基因序列中的两个缺口区的引物，避免延伸跨越缺口区，提高了扩增效率.由于目前所发表的HBV全基因序列均无SalⅠ酶切位点［3］，引物中设计该酶切点，有利于将扩增的片段克隆入载体中，而SapⅠ的识别位点与酶切位点不同，故可通过SapⅠ酶切HBV全基因克隆以获得HBV完整的全基因.引物由上海基康生物技术有限公司合成.序列为:P1:5’-CCGGCGTCGACGA

6、GCTCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3’SalISapI正链nt1821-1841P2:5’-CCGGCGTCGACGAGCTCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3’SalISapI负链nt1825-1806　　1.2.3全长PCR扩增PCP10HBVDNA全基因组质粒以及自血清标本提取的DNA3μL，分别进行全长HBVDNA扩增，同时设置模板为HBVDNA阴性血清和模板提取时所用的无菌水的阴性对照.反应条件为50μL反应体积中加入引物P1，P2各300pm

7、ol・L-1，4×dNTP各0.2mmol・L-1，MgCl21.5mmol・L-1，1×反应缓冲液及Taq/Pin，72℃4min（每循环自动增加延伸5s），40个循环后，于72℃延伸10min.溴乙锭琼脂糖凝胶电泳观察结果.　　1.2.4扩增产物的酶切及克隆扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收后，用SalI酶切，同时酶切载体pUC19.酶切后电泳并从凝胶中回收片段，用T4连接酶连接过夜后，转化大肠杆菌JM109，37℃培养过夜，挑取白色菌落，提取质粒DNA.

8、　　1.2.5克隆产物的鉴定以重组质粒为模板进行HBVS区片段扩增，同时将重组质粒进行3种限制性内切酶分别或联合消化，消化产物用10g・L-1琼脂糖凝胶电泳分析.　　2结果　　2.1全长扩增结果用新建的全长基因扩增方法对10份新鲜乙型肝炎患者血清标本扩增后，3份出现了3200kb扩增片段，而以质粒为模板的扩增则全部出现目的扩增产物的核酸带（图1）.显然，这种方法更适用于对高拷贝模板的扩增.　　图1全长PCR扩增HBV基因组产物的电泳图　略