乙型肝炎病毒全长基因的扩增论文

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1、乙型肝炎病毒全长基因的扩增论文.freelega公司产品.SalⅠ，BglⅡ，HincⅡ限制性内切酶和T4连接酶购自华美公司.蛋白酶K购自Merck公司.HBVDNA检测试剂盒为华美公司产品，其引物针对S基因区，扩增片段长度为580bp.PCP10HBVDNA全基因质粒由解放军302医院惠赠.PE-480扩增仪购自美国PE公司.1.2方法1.2.1血清HBVDNA提取200μL血清与蛋白酶K裂解液1∶1混合（终浓度为20mmolL-1Tris-HCl，pH8.0，10mmolL-1EDTA，100mLL-1SDS，0.8gL-1蛋白酶K）.65℃4h，99℃15min，离心后取上清，常规

2、酚/氯仿抽提2次，无水乙醇沉淀，750mLL-1乙醇洗涤干燥后，DNA溶于20μL双蒸水中.1.2.2引物设计HBV全长DNA扩增技术的关键首先是引物的选择，Gunther等发现，如果延伸越过整个HBV基因序列中的两个缺口区，与扩增连续的基因片段相比，效率约降低1000倍.因此，我们选择了位于整个HBV基因序列中的两个缺口区的引物，避免延伸跨越缺口区，提高了扩增效率.由于目前所发表的HBV全基因序列均无SalⅠ酶切位点［3］，引物中设计该酶切点，有利于将扩增的片段克隆入载体中，而SapⅠ的识别位点与酶切位点不同，故可通过SapⅠ酶切HBV全基因克隆以获得HBV完整的全基因.引物由上海基康

3、生物技术有限公司合成.序列为:P1:5’-CCGGCGTCGACGAGCTCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3’SalISapI正链nt1821-1841P2:5’-CCGGCGTCGACGAGCTCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3’SalISapI负链nt1825-18061.2.3全长PCR扩增PCP10HBVDNA全基因组质粒以及自血清标本提取的DNA3μL，分别进行全长HBVDNA扩增，同时设置模板为HBVDNA阴性血清和模板提取时所用的无菌水的阴性对照.反应条件为50μL反应体积中加入引物P1，P2各300pmolL-1，4×dNTP

4、各0.2mmolL-1，MgCl21.5mmolL-1，1×反应缓冲液及Taq/Pin，72℃4min（每循环自动增加延伸5s），40个循环后，于72℃延伸10min.溴乙锭琼脂糖凝胶电泳观察结果.1.2.4扩增产物的酶切及克隆扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收后，用SalI酶切，同时酶切载体pUC19.酶切后电泳并从凝胶中回收片段，用T4连接酶连接过夜后，转化大肠杆菌JM109，37℃培养过夜，挑取白色菌落，提取质粒DNA.1.2.5克隆产物的鉴定以重组质粒为模板进行HBVS区片段扩增，同时将重组质粒进行3种限制性内切酶分别或联合消化，消化产物用10gL-1琼脂糖凝胶电泳分析.2结果2

5、.1全长扩增结果用新建的全长基因扩增方法对10份新鲜乙型肝炎患者血清标本扩增后，3份出现了3200kb扩增片段，而以质粒为模板的扩增则全部出现目的扩增产物的核酸带（图1）.显然，这种方法更适用于对高拷贝模板的扩增.图1全长PCR扩增HBV基因组产物的电泳图略2.2重组质粒的鉴定以重组质粒为模板的HBVDNA片段扩增，采用S区引物，结果均出现了预期的580bp的扩增产物.选用SalⅠ，BglⅡ，HincⅡ3种限制性内切酶对重组质粒分别或联合消化，其酶切谱基本与文献报道一致［4，5］.2.3HBV全长扩增的重复性以相同样本用该方法多次重复扩增，结果全长PCR目的产物带清晰，重复性稳定.3讨论

6、HBV基因组的特殊结构使扩增全基因较为困难，其中除引物的选择极为关键外，DNA聚合酶的选择也很重要.由于用于标准PCR的Taq酶有很强的5’→3’聚合酶活性，但没有3’→5’外切核酸酶作用，因此Taq聚合酶催化的反应，碱基错误掺入率可高达10-4/碱基/循环，用于全长PCR克隆出单个DNA分子，其序列则不太可靠.但据报道大部分具有较对活性的DNA聚合酶（Vent，pfu，UlTma）扩增有效性至少低于Taq酶1000倍［6］，因此，我们应用了高保真DNA聚合酶，包括Taq和Pesdeterminedbyfull-lengthDNAamplificationanddi-rectsequen

7、cingrevealsnovelanduniquefeatures［J］.JGenVirol，1997;78（7）:1707-1718.［2］GuntherS，LiB，MiskaS，KrugeeD，MeiselH，.Anovelmethodtostudythefull-lengthgenomeofhepatitisBvirus［J］.ZhonghuaChuanRanbingZazhi（ClinInfectDis），1998;16（2