尿毒清胶囊及其拆方对5-6肾切除大鼠肾组织 tgf-β1mrna表达的影

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1、尿毒清胶囊及其拆方对5/6肾切除大鼠肾组织TGF?β1mRNA表达的影汤水福，陈刚毅，洪钦国，林晓敏【摘要】【目的】观察尿毒清胶囊及其拆方对慢性肾功能哀竭（CRF）模型大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF?β1）mRNA表达的影响。【方法】采用5/6肾切除法复制CRF大鼠模型，造模成功的SD大鼠随机分为模型组、黄芪组（剂量1.5g·kg-1.d-1）、丹参组（剂量为1g·kg-1.d-1）、大黄组（剂量为1g·kg-1.d-1）、黄芪丹参大黄组（剂量为1g·kg-1.d-1）、尿毒清组（剂量为1g·kg-1.d

2、-1）；各给药组灌胃给药6周后，检测各组大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平，并采用逆转录聚合酶链反应检测各组大鼠肾组织TGF?β1mRNA的表达水平。【结果】各给药组均可降低血清BUN、Scr水平，与模型组比较均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），其中尿毒清组降低Scr水平作用优于大黄组（P＜0.05）；TGF?β1mRNA在各组肾组织中均有不同程度的表达，其中模型组表达最强烈，尿毒清组和黄芪丹参大黄组表达最轻。【结论】尿毒清治疗CRF的作用与其能下调TGF?β1mRNA在肾组织中表达有关，

3、且中药复方作用优于单味中药。【关键词】尿毒清胶囊/药理学；慢性肾功能哀竭/中药疗法；转化生长因子；疾病模型，动物；大鼠既往研究表明［1］，慢性肾功能衰竭（CRF）的中医病机复杂多变，运用中药复方制剂尿毒清胶囊可以有效改善临床症状，降低血肌酐和尿素氮水平。本实验采用5／6肾切除法复制慢性肾功能衰竭大鼠模型，观察具有益气、化浊、活血之功的中药尿毒清胶囊及其主要拆方对模型大鼠肾功能、转化生长因子（TGF?β1）mRNA表达的影响。现报道如下。1材料与方法1．1动物及造模清洁级SD大鼠70只，雌雄各半，体质量（230

4、±20）g，由广东省医学实验动物中心提供。适应性饲养1周后，按Platt法［2］复制5／6肾切除大鼠慢性肾功能衰竭模型。1．2主要药物、试剂及仪器尿毒清胶囊由广州中医药大学第一附属医院制剂室提供，黄芪、丹参、大黄均由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供并由煎药室统一煎煮，真空包装，保存在4℃冰箱里备用；Trizol购自上海申能博彩；逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）试剂盒购自Takara；琼脂糖由AGROSE西班牙分装；染色剂购于北京赛百盛公司；BeckmanSynchronCX4全自动生化分析仪(美国Bec

5、kman?Coulter公司产品);GDS7600型凝胶成像及分析系统（英国UVP产品）。1．3分组及药物干预造模2周后，将存活的56只大鼠随机分为黄芪组（剂量为1.5g·kg－1·d－1）、丹参组（剂量为1g·kg－1·d－1）、大黄组（剂量为1g·kg－1·d－1）、黄芪丹参大黄组（剂量为1g·kg－1·d－1）、尿毒清组（剂量为1g·kg－1·d－1）、模型组。各组自由进食普通饲料和饮水，连续6周。1．4肾功能水平的检测造模成功后尾静脉取血、灌胃6周后眼眶取血，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐(crea

6、tinine，Scr)、尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)的水平。1．5肾组织TGF?β1mRNA的表达实验主要分为RNA提取和RT?PCR。1．5．1RNA提取采用Trizol试剂盒抽提总RNA。每100mg肾组织加1mL的Trizol，匀浆后转移至1.5mL的Eppendorf（EP）管中；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30s后，4℃、12000r/min离心15min；将上清小心转移到一个新的EP管中，加入与上清等体积的-20℃异丙醇，静置30min后，4℃、12000r/min离心

7、10min；移去上清，用体积分数75%酒精洗涤沉淀1～2次（每次1mL，4℃、10000r/min离心5min）；室温放置5～10min，沉淀即为样品总RNA；沉淀用50μL无RNA酶（RNase）水溶解，并以紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。1．5．2RT?PCR法检测引物的设计与合成：TGF?β1mRNA由上海申能博彩生物技术有限公司合成，上下游引物序列分别为：5，?GGACTACTACGCCAAAGAAG?3，，5，?TCAAAAGACAGCCACTCAGG?3，，引物扩增产物长度294bp。GAPD

8、H上下游引物序列分别为：5，?AGATCCACAACGGATACATT?3，，5，?TCCCTCAAGATTGTCAGCAA?3，，引物扩增产物长度307bp。逆转录（RT）各组样品按下列顺序加样：组织RNA1μg，Olig1μL；5倍Buffer4μg；40U/μLRNaseInhibitor1μL，5U/μL逆转录酶（AMVRTase）1μL。将各组PCR管置50℃温育15min，然后以94℃、