益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织中tgf-β1mrna和colⅳmrna表达的影响

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目录IUIIIIlllllEIIll／IllllIIIIIIIY2j33730咖8l中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织中TGF．]31mRNA和CollVmRNA表达的影响前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8日lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．15附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．18附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3l讨论⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．33结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42综述膜性肾病的中西医治疗进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．67个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．68 中文摘要益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织中TGF．plmRNA和ColIVmRNA表达的影响摘要目的：本研究通过观察益肾通络方对膜性肾病大鼠的24h尿蛋白定量、血液生化检查、肾脏病理及肾脏组织中CollVmRNA和TGF。plmRNA表达的影响，探讨膜性肾病可能的发病机制以及益肾通络方对该病的治疗价值，从而为膜性肾病的治疗提供新的方法和有效的药物。方法：将60只体重为200-±209的健康雄性Wistar大鼠完全随机分为正常组15只，造模组45只，造模组按照制备膜性肾病大鼠的方法：每只大鼠隔日一次在腋下、腹股沟做多点皮下注射阳离子化的牛血清白蛋白(C．BSA)行预免疫，1周后正式免疫，每只大鼠每周3次尾静脉注射阳离子化的牛血清白蛋白(C．BSA)，连续注射4周。造模成功后，将其完全随机分为3组，分别为模型组、益肾通络方组和盐酸贝那普利组。两个治疗组分别给予相应的药物灌胃四周，正常组及模型组均予以等量的生理盐水灌胃，期间各组大鼠均自由活动、进食、饮水。各组大鼠分别于造模前(实验第l周末)、造模后(实验第6周末)和治疗后(实验第10周末)在代谢笼中留取24h尿液，进行24h尿蛋白定量的测定。在实验第十周末各组大鼠腹主动脉取血，检测血清中白蛋(a(ALB)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)的水平，并留取肾组织，分别在电镜、光镜、免疫荧光下观察大鼠肾组织的病理变化情况，采用real-timePCR法监测各组大鼠肾组织中TGF—D1mRNA及ColIVmRNA的表达情况。结果：1各组大鼠24h尿蛋白定量的比较大鼠尾静脉注射C．BSA4周后，除正常组外，其余三组大鼠均出现大量蛋白尿，与正常组相比均有统计学意义(PO．05)；两治疗组治疗前与治疗后24小时尿蛋白定量相比有统计学意义(尸0．05)。3大鼠肾组织的光镜、电镜和免疫荧光观察光镜下正常组大鼠的肾小球结构正常，未见明显变化。模型组大鼠的肾小球体积明显增大，球内细胞增多，肾小球周围有大量炎性细胞浸润，肾小球基底膜(GBM)增厚及上皮下沉积物，小动脉壁增厚。两治疗组肾小球体积轻微增大，肾小球基底膜增厚不明显，上皮下有较少的沉积物。电镜下正常组大鼠的肾小球基底膜无增厚，上皮下未见电子致密物沉积，足突间无融合。模型组可见肾小球基底膜不规则增厚，上皮侧可见大量的电子致密物沉积，足突广泛融合、消失。两治疗组可见肾小球基底膜稍显增厚，肾小球基底膜内有少数电子致密物沉积，足突部分弥漫融合。免疫荧光：正常组未见明显变化，荧光显示强度(一)；模型组可见IgG和C。呈粗大颗粒状沿肾小球毛细血管袢呈弥漫性分布，荧光强度增强，约为(+++～++++)。两治疗组可见IgG矛IC3呈细颗粒状沿肾小球毛细血管袢少量分布，强度约为(+～++)．。4real．timePCR结果分析治疗结束后，与正常组相比，益肾通络方组、盐酸贝那普利组及模型组肾组织中的TGF．13，mRNA及Coil'9mRNA的表达均有不同程度的上调，相比有统计学意义伊O．05)。结论： 中文摘要l吾师根据多年的临床经验以健脾益肾、化瘀通络为治疗大法创立的益肾通络方，是根据膜性肾病本虚标实的发病特点提出来的，并且已有实验证实：益肾通络方是体现此法的有效方剂。2本实验证实益肾通络方确实能降低膜性肾病大鼠24h尿蛋白的含量，升高血浆TP及ALB水平，降低血浆中TC和TG的水平，延缓膜性肾病的发展。3肾脏病理显示益肾通络方能减少免疫复合物在膜性肾病大鼠肾小球基底膜(GBM)的沉积，抑制GBM的增厚，可在一定程度上改善肾脏病大鼠的肾脏病理损害。益肾通络方可能通过下调肾组织中TGF．plmRNA及CoINmRNA的表达，来达到对MN大鼠的肾脏保护作用。关键词：膜性肾病；阳离子化的牛血清白蛋白；益肾通络方；TGF．pl；ColⅣ 英文摘要EffectofYiShenTongLuoDecotionintheExpressionofTransformingGrowthFactorandTypeⅣCollageninKidneyTissueonMembranonsNephropathyModelRatsABSTRACTObjective：ExperimentalstudywastoanalyzetheeffectofYishentongluoDecotionintheexpressionof24hoursurineprotein，bloodbiochemistry,renalpathology,ColIVmRNAandTGF-plmRNAinrenaltissueonmembranonsnephropathy(MN)rats．TheprobablepathogenesisofMNandthetherapeuticvalueofYishentongluoDecotiinMNwereinvestigated，SOastoprovidethenewtherapiesandeffectivedrugsforMN．Methods：60healthymaleWistarratswithbodyweightsat200+209wererandomlydividedintotwogroups：Normalgroupis15，andModelinggroupis45．AccordingtothewayofestablishingMNrats，Modelinggroupmulti-siteinjectedcationicbovineserumalbumin(C—BSA)inunderarmandinguenonceeveryotherdayforpreimmunization，thenestablishedMNratmodalafteroneweekthroughthewayofinjectingC—BSA3timesaweekfor4weeks．AfterthesuccessfulestablishmentofMNmodel，theratsofmodelinggroupswererandomlydividedintothreegroups：Modalgroups，YishentongluoDecotiongroupandBenazeprilgroup．Thetwotreatmentgroupsviaoraladministrationcorrespondingdrugfor4weeks，theothergroupsviaoraladministrationsameamountofdistilledwater．Eachgroupwasfreetomove．eatand越m(．Eachgroupcollectedthe24hurineatmetabolismcageatthreetimepoints：beforemodeling(attheendoffirstweek)，aftermodeling(attheendofsixthweek)，aftertreatment(attheendoftenthweek)．Wetakethebloodinabdominalaortaattheendoftenthweek．ThelevelsofALB，TP,TC，TGScrandBUNinserumwereassayed．Thentherenaltissuewascollected．Pathologicchangesofrenaltissuewereobservedwithelectronmicroscope，lightmicroscopeandimmuofluorescence．ExpressionofTGF一13lmRNA，ColVImRNAinrenaltissuewasobservedwithreal—timePCR．4 英文摘要Results：124hurinaryproteinquantitativeanalysisshowedthatComparedwithNormalgroup，theothergroupsmanifestedsevereproteinuriaafterinjectingwithC—BSAforfourweeks．Therewasasignificantdifference俨O．05)．3Renaltissueofratswasobservedwithlightmicroscope，electronmicroscopeandimmunofluorescenceThelightmicroscopeobservationresultshowedthat：ThestructureofglomerulusinNormalgroupwasnormal．InModalgroup，thevolumeofglomerulusenlargedmarkedly；Cellsincreasedinglomerulus；alotof5 英文摘要—————————————————————————————————●—————————————————一inflammatorycellsinfiltratedintoglomerulus；PASM—HEstainingshowedthatGBMthickeningandsubepithelialdeposition；Renalinterstitiumcouldseealittlelymphandmononuclearcellinfiltration，fibrosis，wallthickeningofsmallarteries．Intwotreatmentgroupsglomeruluswasenlargedslightly,GBMwasn，tthickeningobvious，alittlesubepithelialdepositioncouldbeobserved．Theelectronmicroscopeobservationresultshowedthat：InNormalgroup，GBMwasnotthickening，theelectrondensedepositwasn’tseeninsubepithelial，footprocesswasn’tfusion．InModalgroup，GBMshowirregularthickening，epithelialsidehadquantityofelectrondensedeposit，diffusefootprocesswasfusionanddisappearance．Intwotreatmentgroups，GBMwasthickeningslightly．GBMhadalittleelectrondensedeposit，diffusefootprocesswasfusionpartly．Theimmunofluorescenceobservationresultshowedthat：Therewasn’tsignificantabnormalityinNormalgroup，Fluorescentdisplaystrong(一)；InModalgroup，roughgranularlgGandC3distributedthroughoutthecapillaryloopsoftheglomerulustovariousdegree．Fluorescentdisplaystrengthen，about(+++~++++)．InYishentongluoDecotigroup，alittlefinegranularlgGandC3distributedthroughoutthecapillaryloopsoftheglomerulus，about(+—斗)．4Real-timePCRresultanalysisWhenthetreatmentconcluded，theexpressionofTGF—13ffnRNA，CoIlVmRNAinYishentongluoDecotigroup，BenazeprilgroupandModalgroupelevatedtovariousdegree．therewasasignificantdifference谢ththatofNomalgroup(尸0．05)．Conclusions：1Accordingtomanyyeasclinicalexperience，ourtutorproposed 英文摘要YishentongluoDecoti．Themethodoftreatmentwas“strengtheningspleenandkidney,promotingbloodcirculationforremovingobstructionincollaterals"．AnditwasbasedonMNastheniainoriginandastheniainsuperficiality．Andexperimentalstudyshowedthat：YishentongluoDecotiwaseffectivetreatmentforthat．2Theexperimentalstudyshowedthat：YishentongluoDecoticouldreduceMNrats’24hUrineprotein，improveTPandALBinplasma，reduceTCandTGinplasma，alleviatestheMNprogress．3Renalpathologyshowedthat：YishentongluoDecoticouldreduceimmunecomplexesdepositioninMNrats’GBM，controlGBMthickening，andimprovetheinjuryinMNrats’kidneytosomedegrees．YishentongluoDecoticouldcontroltheexpressionofTGF—plmRNAandCollVmRNAinnephridialtissue，SOastoprovidegoodprotectiononMNrats’kidney．KeyWords：membranousnephropathy(MN)；cationicbovineserumalbumin(C·-BSA)；YishentongluoDecoti；TGF--plmRNA；ColIVmRNA7 研究论文益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织中TGF．13lmRNA和ColIVmRNA表达的影响前言膜性肾病(membranuousnephropathy，MN)是一个病理形态学诊断名词，其特征性的病理改变是肾小球毛细血管袢上皮侧可见大量的免疫复合物沉积伴基底膜增厚，该沉积物局限于肾小球基膜(glomerularbasementmembrane，GBM)的上皮侧。MN是成人原发性肾病综合征中最常见的病理类型之一，约占原发性肾病的十分之-(9．89％)左右(iJ。MN可发生在任何人种、任何年龄，但发病高峰在40岁．50岁，且男性多于女性，男女比例约为2：1，MN起病往往比较隐匿，临床约有80％的患者表现为肾病综合征，其余20％的患者则表现为无症状、非肾病范围的蛋白尿。MN一般无肉眼血尿，部分患者(约30％．50％)可出现镜下血尿，约17％．50％的患者起病时伴有高血压，少数患者(4％．8％)起病时就发现有肾功能不全。本病在治疗上，目前西医多采用激素或(和)免疫抑制剂，但长期大剂量应用激素引起并发症和不良反应甚多，且疗效欠佳，并且停药后易导致病情反复发作，给患者的心理和精神上带来了很大的痛苦，因此各医家开始寻求新的治疗方法。近几年来人们发现中医药在治疗MN上具有一定的优势，并且也越来越重视其作用。根据MN的临床特点将其归属于中医的水肿、虚劳、尿浊等范畴，吾师檀金川教授在多年对MN的治疗上积累了大量的临床经验，根据久病必瘀、久病入络的理论，认为脾肾亏虚、瘀血阻络是MN发病的基本病机，因此创立了以“健脾益肾、化瘀通络"为治疗大法的益肾通络方(黄芪、党参、炒白术、仙灵脾、地龙、水蛭、莪术、当归、绞股蓝)治疗MN，临床疗效显著。本研究通过建立大鼠膜性肾病模型，应用益肾通络方对该模型进行干预性治疗，并通过观察大鼠的尿蛋白定量、血浆白蛋白、总蛋白、血脂、肾功能、肾脏病理形态学改变及肾组织中TGF．p】mRNA及C01ⅣH1】[斟A的表达水平，来观察益肾通络方对MN的治疗作用及作用机制，并为临床应用提供可靠的实验指导和理论依据。 研究论文材料与方法1实验材料1．1实验动物选用健康雄·[生wistar大鼠60只，体重为200+209，清洁级，由河北医科大学动物实验中心提供，许可证号：1205030。实验期间，动物室温度23℃一28℃，湿度60％，采用12h交替照明，动物自由饮水、进食，保持垫料干燥。1．2实验药物(1)益肾通络方组：由黄芪、党参、仙灵脾、地龙、水蛭、炒白术、莪术、当归、绞股蓝组成，这些中药均由河北医科大学中医院提供，并由中医院制剂室将其煎制成所需要的浓度即含生药29／ml，密封放置于40C冰箱中，保存备用。(2)盐酸被那普利组：由北京诺华制药有限公司生产，将此药研磨成粉末，过100目筛，置于4。C冰箱中，用时按10mg／kg／d溶于3ml蒸馏水中给药。1．3实验试剂牛血清白蛋白第五组份(BSA．V)：美[Sigma公司无水乙二胺(EDA)：阿法埃莎(天津)化学有限公司碳化二亚胺(EDC)：美[]sigma公司弗氏不完全佐剂：美[虱Sigma公司水合氯醛：天津市瑞金特化学品有限公司PBS：上海双螺旋生物科技有限公司总蛋白试剂盒(双缩腥法)：北京金豪制药有限公司白蛋白试剂盒(溴甲酚绿法)：北京中生北控生物科技股份有限公司血肌酐测定试剂盒：南京建成生物工程研究所总胆固醇试剂盒(酶比色法)：北京中生北控生物科技股份有限公司甘油三酯试剂盒(酶比色法)：北京中生北控生物科技股份有限公司血尿素氮测试盒：南京建成生物工程研究所羊抗大鼠IgG：美INSigma公司小鼠抗大鼠C3：美国SantaCmz公司 研究论文FITC标记抗山羊IgG：={t京中杉金桥生物技术有限公司FITC标记抗小鼠IgG：北京中杉金桥生物技术有限公司Trizol试齐lJ：Invitrogen公司RT试剂盒：美国Thermo公司real．timePCR试剂盒：大连TAKARA公司PCR引物：北京华大基因科技有限公司TGF—p1F：5’一GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA．3’R：5’．GGAAGGGTCGGTTCATGTCAT．3’扩增产物长度为385bpC01．IVF：5’一GCTCTGTCTGCCAGTGTTTCC．3’R：5’一TGGACCCTTGTCTCCTTTCTC．3’扩增产物长度为179bp13-actinF：5’一CCTGTGGCATCCATGAAAC．3’R：5’一GCTGGAAGGTGGACAGTGAC．3’扩增产物长度为279bp其余试剂均为国产分析纯1．4实验仪器透析袋：美国FisherScientific公司电热恒温水浴箱：H．H·W21·600，天津泰斯特仪器有限公司LGJ．10冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司全自动生化分析仪：Hitachi，7170A型，日本日立尿蛋白(24h)分光光度计：721型，上海第三分析仪器厂高速离心机：TDL．5．A，上海安亭科技仪器厂切片机：AS一325，英国姗顿公司CX41光学显微镜：日本OI，Ⅵ汩US电子天秤：FA2004，上海精科天秤HPIAS．1000型全自动彩色病理图像分析系统：武汉千屏影像技术有限公司超低温冰箱：SANYOULTRALOWJapanlO 研究论文Sigma高速低温离心机Sigma3K30：SIGMA公司JJ．1型定时电动搅拌器：江苏金埴国华仪器厂HITACHl05PR-22低速离心机：HITACHI公司LX．200迷你离心机：海门市其林贝尔仪器QL。901漩涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂恒温磁力加热搅拌器(85．2)：江苏荣华仪器制造有限公司PCRPX2ThermalCycler：美国Thermo公司real．timePCR仪：Gene公司Rotor-Gene3000ND．1000核酸定量仪：美国Thermo公司凝胶成像分析系统：南京捷达公司制冰机：SANYO公司SZ．93型自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂高温灭菌器：S砧吖O公司2实验方法2．1阳离子化牛血清白蛋白的制备参照border$『I]备MN大鼠的方法【2】，将67mlEDA与500ml双蒸水混合，再用6NHCL350ml调整上述溶液的PH为4．75，并将其降温至25。C，再将59牛血清白蛋白(第五组份)溶于25m1双蒸水中并加入到EDA溶液中，随后加入1．89EDC并均匀搅拌，使反应在恒温于25℃和恒定的PH值为4．75条件下进行120min，最后加入30ml4M醋酸盐缓冲液(PH=4．75)以终止反应。将上述溶液在4。C的双蒸水中连续透析72小时(每34,时换一次透析液)，在真空冷冻干燥机内干燥成粉末，即制成C．BSA。分装密封保存于．70。C冰箱内，注射前使用PH=7．4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成溶液。．2．2实验动物分组及模型复制2．2．1动物分组实验动物购回实验室后，适应性饲养1周，实验前将大鼠置于代谢笼中留尿，用尿蛋白试纸测定蛋白均为阴性，检测各组大鼠24／J、时尿蛋白定量<10mg。将60只大鼠完全随机分为正常组15只，造模组45只，造模成功后，将其完全随机分为3组，分别为模型组、益肾通络方组和盐酸贝那普利组。2．2．2模型复制【3’4】 研究论文造模组每只大鼠使用C．BSAlmg，加入0．5mlPBS@，再与等量的弗氏不完全佐剂混匀，配制成乳白色的悬浊液，分别在大鼠的双侧腋下、腹股沟作多点皮下注射进行预免疫，每周三次，共一周。预免疫1周后，每只大鼠尾静脉注射C．BSA16mg／Kg(溶于lmlPH值为7．4的PBS中)，隔日～次，每周三次，共4周。2．3大鼠给药情况(1)正常组：15只，每日灌服与治疗组给药相当计量(3m1)的生理盐水一次，连续4周。(2)模型组：14只，每日灌服与治疗组给药相当剂量(3m1)l拘生理盐水一次，连续4周。(3)盐酸贝那普利组：14只，在造模成功后，将研磨成粉末的盐酸被那普利，按10mg／Kg／d溶于3ml蒸馏水中，每日一次灌胃，连续4周。(4)益肾通络方组：14只，在造模成功后，取煎制好的益肾通络方汤剂，按209／Kg／d力D蒸馏水至3ml，每日一次灌胃，连续4周。3一般指标的观察及标本留取3．1一般情况观察实验大鼠的体重、摄食、饮水、体毛及精神状况。3．2标本留取3．21124h尿液分别于造模前、造模成功后及给药4周后将大鼠放置于代谢笼中，收集大鼠的24h尿液，记录下大鼠的24h尿量，并用普通滤纸过滤后再测定24h尿蛋白定量：3．2．2血生化指标在灌胃给药4周末，用10％的水合氯醛，按300mg／Kgl拘剂量给大鼠腹腔注射进行麻醉，麻醉后，剖开腹腔，腹主动脉采血5ml，于37。C水浴箱内静置30分钟后，以3000rpm离心机离心10分钟取血清。用7170A型自动生化分析仪分别测定血清标本中的白蛋白(Albumin，ALB)，总蛋∈t(TotalProtein，TP)，甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(TotalcholesteroI，TC)、尿素氮(Bloodureanitrogen，BUN)、肌酐(Creatinine，Cr)水平。3．2．3肾组织病理学观察大鼠采血后，即刻剖出肾脏，取一侧肾上极皮质区域的肾组织，分别 研究论文留取用于光镜、免疫荧光及透射电镜的肾脏标本以便观察；同时并留取另一侧肾组织的皮质区域迅速放入液氮中保存，留做real．timePCR。3．3光镜观察肾组织经4％的多聚甲醛溶液固定后，酒精梯度脱水，二甲苯透明，行石蜡包埋，制成约29m的石蜡切片，分别行HE、PAS、Masson染色，观察肾小球及肾间质的变化情况。3．4免疫荧光观察采用间接免疫荧光法检测lgG和补体C3，具体步骤如下：(1)取米粒大小的新鲜肾皮质组织，制成冰冻切片，厚约59in；(2)切片经冷丙酮固定8至10min，略晾干后用PBS冲洗3min，3次；(3)滴加1滴(5斗1)一抗(1：50)，放置湿盒内于37。C孵育1,b时，PBS冲洗3rain，3次；(4)滴7311滴(5山)FITC标记二抗(1：50)，置湿盒内于37。C孵育30min，PBS冲洗3min，3次；(5)用PH值为9．0的缓冲甘油封片镜检并拍照记录。根据显微镜下显示的荧光强度将其分为O~4+级：O级：低倍镜和高倍镜下均不可见；1+：低倍镜下不可见，高倍镜下可见；2+：低倍镜下可见，高倍镜下清晰；3+：低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；4+：低倍镜及高倍镜下均强烈耀眼。3．5电镜观察在留取的肾组织中每组随机选取1个标本，经4％戊二醛5}I1％锇酸磷酸钠缓冲液后固定后，丙酮梯度脱水，常规包埋、修块、LEICAUCT超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，用透射电镜观察肾小球基底膜、足突等的变化情况。3．6real—timePCR法观察肾组织中TGF．[31mRNA及Cot—IVmRNA的表达情况3．6．1Trizol法提取RNA(全程冰上操作)：(1)每50—100mg组织加入lmlTrizol，静置5min，冰浴匀浆；(2)加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，静置3min，4。C12000ffl5min离心，吸取上层液，移至另一EP管中；(3)每管加入500ul异丙醇，颠倒混匀15s，静置10rain， 研究论文4℃12000fflomin，弃上层液体，留RNA沉淀；(4)每管加入lml75％乙醇(DEPC水配制，临配临用)，将RNA沉淀弹起，清洗砌蚣沉淀，7500r／5min；(5)弃75％乙醇，留RNA沉淀，用适量DEPC水溶解。3．6．2RNA鉴定和定量(1)取l“lRIgA溶液加2ulRNA．buffer混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察RNA的纯度和完整性，见18S、28S条带完整、清晰，28S带的宽度及亮度是18S的2倍，表明RNA完整无降解。(2)取2glRNA溶液，用NanoDropND．1000紫外／可见光光度计进行定量，测定RNA浓度，OD260／280比值在1．8—2．0范围内。3．6．3反转录反应(1)反转录反应体系(10}t1)5xPrimeScriptTMBuffer29lPrimeScriptTMRTEnzymeMixIO．59l随机引物(O．299／91)O．59l总RNAO．599DEPC水至10ul(2)反转录反应过程终浓度1xbuffer0．01gmol／gl50ng／gl将上述成分加到0．2rnl的微量EP管中，混匀，37℃／15min，85℃／5s，之后置于冰水浴中冷却，得到cDNA，一20℃保存，备用。3．6．4real．timePCR反应(1)PCR反应体系(20H1)体积终浓度SYBR?PremixExTaqTM(2x、)10}tl1xbuffer不同倍数稀释的cDNA2“l上游引物(109mol／L)0．29lO．1gmol／L下游引物(101xrnol／L、)0．29lO．1gmol／L水加至209l3．6．5real．timePCR循环参数的设置及条件的确定根据引物合成单上的Tm值，做预实验确定适当的退火温度和循环数(1)13-actin的扩增条件为：95℃30S14 研究论文95℃59℃72℃(2)TGF．pl的扩增条件为：95℃59℃72℃至蚕i)4。cyc—es(3)CollV的扩增条件为：95℃59℃72℃5s]22。0ss，40cycles3．6．6real．timePCR反应结果分析以13-actin为内参，采用ACt(Ct目的--Ct内参)法进行相对定量分析，以2’△Q作为目的RNA的相对表达量。4统计学处理采用SPSSl7．0统计处理软件分析。计量数据均以X+s描述，组内比较用配对t检验，组间比较用LSD法，P知．05为差异有统计学意义。结果1实验动物的一般情况观察正常组大鼠活动正常，反应灵敏，毛色光泽，食欲旺盛，体重增长较快，大小便无明显变化。其余三组大鼠在进入造模后全部出现毛发脱落，皮毛欠光泽，精神萎靡，反应迟钝，喜静恶动，进食减少，大便溏，小便量少，抗抓持能力降低等，部分大鼠出现阴囊水肿、腹部胀大，尾部注射部位溃烂，死亡三只，分析其原因可能是药物过敏及尾部溃烂感染。治疗组大鼠在给药后上述各种情况开始改善，至给药结束后一般情况基本恢复至造模前水平，模型组大鼠情况继续恶化，未见好转趋势。2各组大鼠生化指标的比较 研究论文2．1各组大鼠24d'时尿蛋白定量的比较(见Fig．1、Table1)结果显示：造模后造模组大鼠出现明显的蛋白尿，蛋白尿在注射C。BSA第4周末达到高峰，与正常组比较，有统计学意义愀0．05)，提示造模成功。盐酸贝那普利组、益肾通络方组与模型组各组间尿蛋白水平无统计学意义(pO．05)。在给药4周后盐酸贝那普利组、益肾通络方组大鼠的尿蛋白定量与给药前相比明显降低，有统计学意义衅O．05)；盐酸贝那普利组、益肾通络方组大鼠的尿蛋白定量水平与模型组比明显降低，有统计学意义(PO．05)。 研究论文附图Fig．1Thechangesof24hurineprotein(mg／24h)infourgroups(：t+s)Fig．2ALBandTPofbloodserminfourgroups(x+s)18 研究论文Fig．3TCandTGofbloodserminfourgroups(：文+s)Fig．4ComparisonofBUNandCRinfourgroups(x+s)19 研究论文fGF一81㈣C01Ⅳ删Fig．5ExpressionofCollVmRNAandTGF—fhmRNAineachgroup(：圣士s)Fig．6Model(HEx400)20％毗m¨M¨mⅥ0^iU^iU^iU^iU^iU 研究论文Fig．7Benazepril(HEx400)Fig．8TCM(HEx400) 研究论文Fig．9Normal(HEx400)Fig．10Model(Massonx400) 研究论文Fig．11Benazepril(Massonx400)Fig．12TCM(Massonx400)23 研究论文Fig．13Normal(Massonx400)Fig．14Model(PASx400)24 研究论文Fig．15Benazepril(PASx400)Fig．16TCM(PASx400)25 研究论文Fig．17Normal(PASx400)Fig．18Model(IMFx400)26 研究论文Fig．19Benazepril(IMFx400)Fig．20TCM(IMFx400)27 研究论文Fig．21Normal(IMFx400)Fig．22Model(TEMx20000)28 研究论文Fig．23Benazepril(TEMx20000)Fig．24TCM(TEMx20000)29 研究论文Fig．25Normal(TEMx20000)30 研究论文附表Table1Thechangesof24hurineproteininfourgroups(x+s)(mg／24h)Note：aftermodelVSbeforemodel：◆P0．05Note：VSNormalGroup：◆P<0．05VSModelGroup：◇P<0．05TCMGroupVSBenazeprilGroup：★P>0．05 研究论文Table3ComparisonofbloodsermTCandTGinfourgroups(x士s)(mmol／L)Note：VSnormalgroup：◆P<0．05VSmodelgroup：◇P<0．05TCMGroupVSBenazeprilGroup：★P>O．05Table4ComparisonofbloodsermBUNandScr(x+s)Note：therewasnosignificantdifferenceinthelevelofBUNandScrinfourgroupsTable5ExpressionofTGF一[3,mRNAandCOllVmRNAineachgroupRats(爻±s)Note：VSNormalGroup：◆P<0．05VSModelGroup：◇P<0．05TCMGroupVSBenazeprilGroup：★P>O．0532 研究论文讨论1膜性肾病的临床表现及发病机制1．1MN的临床表现及分类膜性肾病(MN)是成人原发性肾病综合征中最常见的病理类型之一，约占原发性肾病的十分之一(9．89％)左右【5】。MN可发生在任何人种、任何年龄，但发病高峰在40岁．50岁，且男性多于女性，男女比例约为2：l，成人与儿童之比约为26：1。MN起病往往比较隐匿，临床约80％的患者表现为肾病综合征，其余20％的患者则表现为无症状、非肾病范围的蛋白尿。MN一般无肉眼血尿，部分患者可出现镜下血尿，17％一50％的患者起病时伴有高血压，少数患者起病时就发现有肾功能不全。MN分为原发性膜性肾病也叫特发性膜性肾病(idiopathicmembranousnephropathy,IMN)矛I继发性膜性肾病两大类，特发性膜性肾病发病原因不明，约占膜性肾病的80％；继发性膜性肾病(约占20％)Eh继发因素引起，如：感染、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、药物治疗及肾移植新生肾炎。1。2MN的发病机理目前认为MN发病机制主要是三种模式：(1)肾小球基底膜本身可作为抗原产生抗肾小球基底膜抗体，抗原与抗体在肾小球内结合，激发免疫反应从而导致肾炎的发生；(2)由于抗原的理化或免疫学特征，可预先种植或结合于肾小球基底膜，后在原位形成免疫复合物，最后导致肾炎的发生；(3)免疫复合物在血液中随血液循环，在流经肾小球时激活补体系统从而导致肾炎的发生。殊途同归，研究表明【6】：上皮下原位免疫复合物形成后，补体系统被激活，形成膜攻击复合物，上皮细胞受破坏后释放出大量炎症介质以及活性氧、蛋白酶、细胞因子、生长因子、血管活性分子、细胞外基质等物质，肾小球基膜因而受到破坏并产生蛋白尿。1．3MN的发展趋向MN的预后差别较大，存在肾功能逐渐恶化和自发缓解两种倾向，约30％左右的患者在病程中可以自发的完全缓解；50％的患者虽然可表现为大量蛋白尿，但病情在长期内是相当稳定的；除此之外，仍有20％．30％的患者肾功能逐渐减退并进入终末期肾脏病(endstageofrenaldisease，ESRD)。 研究论文2中医对MN肾病的病名及病机的认识在祖国医学中并无“膜性肾病”病名的记载，根据其临床常以高度水肿、大量蛋白尿等为特征，可将其归属于中医的“水肿"、“尿浊"、“虚劳”等范畴论治。本病的病机多为本虚标实，本虚以脾肾两虚为主，标实多表现为水湿、湿热、瘀血等病理性实邪，但其中尤以瘀血阻络贯穿疾病始终。本虚是该病发生的主要矛盾，也是疾病发生发展的基础。众医家认为本虚主要以脾、肾亏虚为主，脾虚不能运化水湿，肾虚不能蒸化津液，可致水湿内停，泛溢于肌肤发为水肿；脾主升清，肾司封藏，脾虚失于升清，肾虚失于封藏，可致谷气下注，精微下泄，导致蛋白尿。脾虚日久，后天之本不充；肾虚日久，温煦滋养失职，两者相互影响，致使本病更加缠绵难愈。标实则多表现为水湿、湿热、瘀血等病理性实邪，但瘀血是贯穿本病始终的重要因素。水湿内停，郁久化热，而致湿热内蕴，湿热已成，困遏中焦，蕴结下焦，阻碍脾之升清，肾之闭藏，致水湿泛溢、精微下注之势更甚；另湿可阻遏气机，使气滞不行，热可伤津耗气，使气虚津亏；气滞可致血行不畅，气虚可致运血无力，津亏则生血无源，均致脉络瘀阻，瘀血乃成。湿瘀互结，致使本病缠绵难愈，病程较长。3益肾通络方的立方依据及组方特点吾师檀金川教授长期从事于肾脏病的临床治疗和科学研究，其根据中医对膜性肾病的认识及自己的临床经验，结合临床用药的规律及本病发病的关键病机“脾肾亏虚，瘀血阻络”，创立了以“健脾益肾，化瘀通络’’为治疗大法的方剂，将其命名为益肾通络方。该方的主要药物组成为：黄芪、炒自术、党参、当归、地龙、水蛭、仙灵脾、莪术、绞股蓝等。本方用药严谨，理法分明，临床疗效确切f7。u】。方中用大队补气之药黄芪、党参、炒白术、绞股蓝，健脾补气，使气旺以促进血行，活血祛瘀而不伤正；仙灵脾补肾壮阳，温肾阳而不燥，与黄芪合用，使脾肾同补，既固先天之本，又充后天之源；地龙清热熄风，通络利尿，水蛭有破血、逐瘀、利水之功，能破瘀血不伤新血，纯系水之精华生成，于气分毫无损，而使瘀血默然消于无形，在此处与黄芪合用，可使气足以帅血行，助水蛭破血清瘀【12】；当归活血补血，能扶正化瘀，活血不留瘀；莪术破血祛瘀，使久瘀之血得散，行气散结，加强破血散瘀之功。方中加用虫类药，能入络搜剔，直达病所， 研究论文能达到清除宿邪之用。诸药共用标本兼治，使脾肾之气得补，瘀血得消，共凑健脾益肾，化瘀通络之效。现代药理研究证明，黄芪具有较好的降尿蛋白、降糖、降压、扩张血管的作用【l31。能降低血脂及血小板黏附率，减少血栓的形成，通过调节肾脏一氧化氮合酶的表达来改善肾脏的血流动力学[141；能有效的抑制慢性肾脏病大鼠肾组织内TGF．p的过度表达115】；能抑制肿瘤坏死因子a(a'NF．Q)的表达，减慢肾小球基底膜的增厚速度【l6】；另有研究发现，黄芪与当归合用可促进肝脏的白蛋白合成，使血液中的白蛋白增加，改善肾脏血流量，缓解肾病综合症的血液高黏状态[171。地龙提取液能提高大鼠血浆总纤溶酶原激活剂的活力【18】；能抑制血栓形成的作用，可以明显的延缓血小板血栓及纤溶蛋白血栓的形成时剐19】。地龙提取物蚓激酶有抗凝血及溶血栓的双重作用，肾脏病患者血液经常处于高凝状态，易于形成血栓，这时应用蚓激酶即抗凝又不影响止血，还有利于防止血栓形成。水蛭含水蛭素、组胺样物质、肝素和抗血栓素等成分，有较好的抗凝、抑制血小板聚集、扩张血管、降低血液黏稠度、溶栓、升高血6．酮．PGFla、降低血TXB2[2妣2】及促进血液循环的作用，能明显减少蛋白尿、减轻肾实质损害的功效【23J；能显著降低血清肌酐、尿素氮水平，对缺血肾单位有确切的保护作用【2训。还有研究发现黄芪、水蛭及其配方能有效降低细胞外基质的主要成分ColIV和FN的含量【251，还能使大量MC处于G0／G1期，阻止细胞进入S期从而达到抑制MC增生的目的【26|。白术具有明显的利尿作用，其利尿作用以利水排钠为主，其还有抑菌、抗凝血、增加血浆白蛋白、增强垂体．肾上腺皮质的功能【27J。能提高人体的细胞和体液免疫功能增强机体清除自由基的能力，具有明显的抗氧化作用【281。莪术有抗病毒、抗菌、抗血栓及抗肿瘤的功效[29、301，能持续明显的减少尿蛋白，改善微循环，抑制免疫损伤，防止肾间质纤维化和肾小球硬化，对难治性肾病综合征有一定的疗效【31】；实验证实莪术能促进。肾脏细胞外基质的降解，减少细胞侵润及TGF．p的产生，预防或减少细胞外基质的聚集，减轻肾脏的病理损害，从而改善肾脏功能【321。其为延缓肾组织纤维化、硬化性病变的关键用药。仙灵脾可降糖、降压、降脂，抗血栓形成、扩张外周血管、减轻三高的危害、保护残存肾单位；还可以减少肾脏细胞外基质的聚集，延缓’肾小球的硬化，抑制肾小管萎缩和间质纤维化，减缓肾纤维化发展的速度；可增强机体免 研究论文疫力，抗衰老，促进造血功能及改善阳虚症状，从而延缓肾脏病进展的速度【331。党参可抑制血小板聚集、抗凝，调节免疫功能，能通过降低肾小球内的压力而减轻尿蛋白，从而达到保护肾功能的作用【341。绞股蓝的主要有效成分：绞股蓝皂苷，其含有与人参皂苷Rbl、Rb2、F2、Rd结构完全相同的皂苷成份【3引，有降血脂、抗动脉粥样硬化、降低血糖、抗血栓形成、抗衰老、调节免疫功能、增加脏器的血流量等作用[361。孙万森等[371研究发现，绞股蓝皂苷能降低慢性肾衰竭患者的血脂，升高其血红蛋白，改善肾功能及保护肾脏。张永等【38】研究表明，绞股蓝皂苷具有抗梗阻性肾病大鼠肾纤维化的作用。金李君等【39】研究发现，绞股蓝总甙能明显抑制实验性DN大鼠TGF．pl过度表达，从而减少肾小球系膜区ECM的积聚，保护肾脏功能，延缓病程的进展。常獍宇等【40】研究表明绞股蓝总苷能降低高脂血症家兔肾小球Desmin蛋白、0c．SMA蛋白表达，起到保护足细胞和系膜细胞的作用。4本实验动物模型的选择目前关于研究中医药干预MN的经典动物模型的制作方法，包括以下2种：(1)Heymann肾炎的动物模型：Heymann等【4l】采用同等大鼠的肾皮质均浆与弗氏佐剂混合，免疫大鼠，6"---8周后大鼠产生大量的蛋白尿，其肾脏的主要病理改变为肾小球上皮细胞下有免疫复合物沉积和肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚，这是主动型Heymann肾炎(At4N)；Sugiski等用抗肾皮质的抗体免疫大鼠，5．7天后受试动物出现了上述改变，用这种方式建立的肾炎模型称为被动型Heymann肾炎(PHN)。因其病理改变跟人类MN极为相似，所以Heymann肾炎一直作为研究MN的经典动物模型。(2)采用阳离子化的牛血清白蛋Ka(c．BSA)$1J作MN的动物模型【42J：这是个经典的免疫复合物肾病模型。根据不断的研究和改进，现在多采用的是C．BSA作为抗原，以C．BSA和弗氏不完全佐剂混匀后多点皮下注射，预免疫一周后，再隔日一次于耳静脉或尾静脉注射C—BSA，总共四周。该模型制作方法已经在家兔及大鼠上复制成功。从造模第二周起便出现蛋白尿，随静脉注射的时间加长而出现大量的蛋白尿。该模型成功的机理是：带正电的C．BSA与肾小球基底膜上带负电的部位结合，“植入"在肾小球基底膜上，使机体产生相应的抗体与抗原，并在原位形成免疫复合物。该模型的优点是：发病率高，重复性好，实验周期短，具有人类MN的病 研究论文理类型特点及肾病综合症的临床表现，而无肾功能损害，适用于药物防治和新药开发的研究。基于此优点本实验采用的是C．BSA制备的MN动物模型。在采用此法制备MN动物模型时，大鼠尾静脉注射C．BSA按16mg／Kg的剂量注射，因为此剂量是目前研究发现最安全、最稳定的造模计量‘431。在本实验中，造模组大鼠连续4周尾静脉注射C．BSA后，出现大量尿蛋白，治疗4周末造模组大鼠血清中ALB、TP降低，血脂增高，肾功能无明显改变，肾组织电镜、光镜与免疫荧光均出现相应的病理改变，符合膜性肾病的特点，提示用C．BSA制备的MN动物模型造模成功。5阳性对照药物在慢性肾脏病中的应用盐酸贝那普利作为一种常用的ACEI类降压药，研究表明，(1)其扩张肾小球出球小动脉的作用强于扩张入球小动脉的作用，能直接降低出球小动脉的阻力，减轻肾小球内毛细血管的压力，改善肾小球内的“三高”(高压、高灌注、高滤过)症状，因而能有效延缓肾脏疾病的进展脚】，(2)能阻断血管紧张素II(AngII)，其通过阻断AngII可以改善肾小球基底膜负电荷的丧失，保护肾小球基底膜结构的完整性，降低其通透性，减少尿蛋白的排泄，抑制系膜细胞增生及细胞外基质积聚【45、461。此外，盐酸贝那普利由肝、肾双通道排泄，对肾脏有更好的保护作用。原发性膜性肾病常以蛋白尿为主要临床表现，研究发现，ACEI类药物有降低蛋白尿的功效【47】，故本实验选用盐酸贝那普利作为阳性对照药物，来对照益肾通络方对MN大鼠的治疗作用是有效可行性的。6益肾通络方对膜性肾病大鼠的干预作用6．1益肾通络方对MN大鼠蛋白尿及生化指标的影响MN在临床上常表现为水肿、大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症。临床研究发现MN的严重程度与蛋白尿有关。蛋白尿的出现不仅是肾小球疾病的重要变现之一，更是促进MN肾功能恶化的一个独立的、危险的因素。本实验结果显示：造模成功后各组均出现大量的蛋白尿，且无明显差异；在治疗4周后，益肾通络方组、盐酸贝那普利组与模型组相比有统计学意义愀O．05)，但是益肾通络方组与盐酸贝那普利组相比差异不大，无统计学意义胗O．05)，这说明益肾通络方改善膜性肾病蛋白尿的功能与盐酸贝那普利组相当。同时，在实验过程中，治疗后盐酸贝那普利组、 研究论文益肾通络方组与模型组相比，血清TP、ALB明显升高，有统计学意义fP89／d，血浆白蛋1刍<209／L，应用利尿剂或长期卧床等)的患者应积极抗凝治疗。可给予双嘧达莫、阿魏酸哌嗪分散片、阿司匹林、氯吡格雷口服；明显高粘血症和高凝血症的可以使用低分子肝素5000IU，皮下注射，每日1．2次；或尿激酶5万U每日1次，静脉滴注，共用20．30天。但需同时监测患者的凝血功能。(3)低蛋白饮食：对于大量蛋白尿的患者低蛋白饮食可以起到降低蛋白尿，减轻尿蛋白本身对肾小管间质的损害和延缓肾功能的进展。大量蛋白尿的患者饮食中蛋白质的摄入量宜控制在0．6．0．89／(Kg．d)，同时给予充分的热量以减少组织蛋白的分解，总热量一般应保证146．54kJ(35kcal)／(Kg．d)。(4)盐的摄入：水肿患者应当限制盐的摄入，每日盐的摄入量应控制在2—39。(5)高脂血症：高脂血症影响肾脏血流，促进肾小球硬化，降低肾小球滤过滤，促进肾功能的恶化，并导致动脉粥样硬化，增加了冠心病、脑卒 综述中的风险。本病患者高脂血症多伴有血胆固醇和甘油三酯的水平升高。以甘油三酯升高明显的宜选用纤维酸类降脂药，如菲诺贝特、苯扎贝特；一胆固醇增高为主者宜选用羟甲基戊二酰辅酶A(HMG．CoA)还原酶抑制剂(即他汀类)，如辛伐他汀、阿托伐汀、氟伐他汀等。虽然本病患者血清胆固醇水平很难控制在正常水平，但他汀类的降脂作用与抗氧化药物、抗炎药物、免疫调节剂及抗血栓药物联合应用可以起到抗动脉粥样硬化的作用【9】o1．4．2免疫治疗免疫抑制剂的治疗取决于其蛋白尿的程度、持续时间以及肾功能的状态。一般认为24d'时尿蛋白定量>3．59／d伴肾功能减退，或24tb时尿蛋白定量>89／d的高危患者应予以免疫治疗。(1)糖皮质激素(Corticostioid)糖皮质激素是第一个用来治疗IMN的免疫抑制剂药物。多年来大量临床循证医学研究证明糖皮质激素在诱导膜性肾病患者蛋白尿的缓解及肾功能的保护方面，无论是短期还是长期口服均无明显益处，故不主张单独应用激素治疗本病【lo】。(2)糖皮质激素联合细胞毒药物：①激素+环磷酰胺(Cyelophosphamide，CTX)BrantenAJW[111运用Ponticelli[121提出的激素+环磷酰胺方案治疗肾功能不全的MN肾病患者，具体方案：第1个、3个、5个月初给予甲泼尼龙1000mg静脉滴注，连续三天，隔天口服泼尼松0．5mg／Kg，共六个月，同时给于口服环磷酰胺1．5．2mg／(Kg．d)，共l2个月，平均随访32(6—104)个月，开始治疗后患者肾功能迅速改善，在治疗12个月时，患者血清肌酐、尿蛋白定量均明显下降，并且疗效具有持续性。简桂花等【l3】采用的是口服泼尼松lmg／(Kg．d)，2个月后，每2周减量10％，减至30mg／d时，每月减量5mg到维持计量，同时予以环磷酰胺o．89静脉滴注，每月一次，总量小于99。12例患者中完全缓解的有6例，部分缓解的有3例，无效的3例，总有效率75％。②激素+苯丁酸氮芥(Chlorambucil，CH)在众多联合方案中，Ponticelli[141等提出的意大利方案最先受到注意，具体方案：甲泼尼龙和苯丁酸氮芥6个月周期性治疗。具体方案为第1个、3个、5个月的前3天给予甲泼尼龙1000mg静脉滴注，连续三天，后继续口 综述服泼尼松0．4mg／(Kg．d)，在第2个、4个、6个月口服苯丁酸氮芥0．2mg／(Kg．d、)，总疗程半年，能有效减少蛋白尿和保护肾功能。③环孢素A(Cyclosporin。CsA)环孢素是一种选择性的强效免疫抑制剂。作用机制：环孢素与T细胞胞浆中的环啡啉(Cyelosphilin)结合，抑制T细胞的功能，在分子水平上通过干扰转录因子与儿．2助催化剂的结合，来抑制IL．2、■干扰素受体的产生，减少了细胞毒T细胞的聚集作用及其他细胞因子的产生与聚集，以达到使炎症反应减少或消失的目的【l51。研究证明环孢素A+泼尼松或单纯环孢素A对肾功能正常的MN患者均有效116]。小剂量、较长疗程的环孢素A的维持治疗对疾病的缓解是有作用的。环孢素有肝、肾毒性，其造成肾毒性常见于剂量>5mg／(Kg．d)5f11(或)存在肾小管间质纤维化的患者，对肾功能不全患者应用需谨慎。应用此药时，对血药浓度的检测有利于躲避环孢素的不良反应。环孢素停药后，部分患者会复发。④吗替麦考酚酯(MycophenolateMofetil，MMr)MMF是一种新型免疫抑制剂，其作用机理：MMF的活性代谢产物霉酚酸(MPA)，可以选择性的抑制T、B淋巴细胞的增值，抑制细胞毒T细胞的分化和B细胞抗体的形成，对其他细胞仅轻微的有抑制作用，MPA可以抑制粘附分子糖基化及细胞粘附分子的合成，有效的抑制白细胞与内皮细胞的粘附，从而达到减少炎症细胞在局部聚集、发挥抗炎作用的目的【171。从目前国内外的研究报道来看，MMF的临床疗效较好，副作用少，几乎没有肾毒性，对有肾功能恶化的患者有较好的辅助治疗。MMF与激素的作用机制有所不同，所以MMF联合小剂量激素联用可以有效地治疗MN，降低蛋白尿，稳定。肾功能，且不良反应轻微。39届美国肾脏病学术会议上对MN应用细胞毒性药物达成共识：对环磷酰胺无禁忌症的，首选环磷酰胺，若疾病复发的，考虑选择MMF；对环磷酰胺有禁忌症的，首选MMF，如果复发，考虑MMF联合泼尼松治疗【181。⑤他克莫司(Tacrolimus，FK506)他克莫司又称普乐可复，和环孢素A一样，属于神经钙蛋白酶抑制剂，通过与细胞浆内的蛋白(FKBP．12)结合成复合物，来阻止钙离子依赖性T细胞的信号传导，从而抑制了免疫应答过程中多种细胞因子的表达，因此达到体液免疫的作用【191。FK506的免疫抑制作用是CsA的10—100倍，他的 综述特异性高，且不良反应少[201。目前有关他克莫司治疗MN患者的研究报道中病例数少、疗程短，缺乏大样本、随机对照的I临床实验研究，因此FK506在对MN的治疗作用中的应用有待进～步研究。⑥雷公藤多甙雷公藤提取物雷公藤多甙作为治疗肾脏疾病减少蛋白尿的作用被报道是在1997年【21、221，现国内采用雷公藤多甙治疗肾小球肾炎，其作为免疫抑制剂在治疗肾系疾病中得以广泛应用的报道已经很多，大量研究123、24】证明雷公藤具有较强的抗炎及免疫抑制的作用，其能减少免疫复合物在肾小球基底膜的沉积，有明显降低尿蛋白的作用。同时还可增强肾上腺皮质的功能，对下丘脑二垂体一肾上腺轴有兴奋的作用，它拥有激素样作用而无激素的副作用。目前公认的雷公藤多甙治疗肾小球肾炎的机制是：能诱导T细胞凋亡，抑制活化T细胞的增值，阻止了IL．2的产生，从而发挥了对肾小球肾炎的治疗作用【25、261。现多采用雷公藤多甙片联合小剂量激素的方法治疗MN，能协同抑制蛋白尿，提高稳定性，降低复发率，完全缓解率高，不良反应少。⑦来氟米特(Leflunomide，LEF)来氟米特具有免疫抑制和抗炎的作用，它是一种相对低毒的免疫调节药，作为一种新型的免疫抑制剂，在风湿病和和器官移植的治疗中已被广泛应用，但关于用来氟米特治疗原发性肾小球疾病的报道很少。来氟米特作用机制：通过多种环节抑制体液和细胞介导的免疫反应，阻断多种细胞因子介导的信号传导，使T、B淋巴细胞的活化受到抑制，下调内皮和单核细胞粘附分子的表达，减少单核细胞在炎症部位的聚集，从而抑制炎性反应【27_81。有研究证实来氟米特的活性代谢物可以抑制人的肾间质成纤维细胞的增值及I、Ⅳ型胶原蛋白的合成；抑制受损的肾小管间质中TGF．p1的表达，减少细胞外基质的聚集，减轻肾间质的纤维化【2粥21。临床观察发现【3孓35J来氟米特与激素联合应用治疗难治性膜性肾病6个月，可以显著降低患者的蛋白尿及血脂，明显减少血尿、升高血浆白蛋白，稳定肾功能，疗效与环磷酰胺及霉酚酸酯相当，但安全性优于环磷酰胺。(3)新型治疗药物己酮可可碱(Pentoxifylline)、抗B细胞表面CD20的单克隆抗(Rituximab)、抗Cs单克隆抗体(Eculizumab)等，目前均处于临床探索性研 综述究中，还缺乏大量的临床证据证实其作用，需要通过大量的临床研究来证实其作用。1．5小结MN的自然病程差距较大，影响因素较多，对药物的治疗相对不敏感。到目前为止，MN的治疗尚无统一的标准方案。近年来，用免疫抑制剂治疗此病取得了一定的疗效，但对于MN患者是否进行免疫抑制剂治疗、如何进行免疫抑制剂治疗都存在很大的争议。所以在用免疫抑制剂治疗MN的患者时，需要根据患者症状及危险程度的不同，使用不同的治疗方案，并且在治疗中应注意个体化差异，还应注意对高血压、高血脂的处理及减少任何一种免疫治疗的副作用。2膜性。肾病的中医治疗进展2．1中医对膜性肾病病名及病机的认识2．1．1对病名的认识在祖国医学中并无“膜性肾病”病名的记载，根据其临床常以高度水肿、大量蛋白尿等为特征，可将其归属于中医的“水肿"、“尿浊”、“虚劳"等的范畴。水肿在《内经》中被称为“水”，并根据其不同的症状将其分为“风水”、“石水"、“涌水”，并在《灵枢·水胀》中对本病的症状作了仔细的概述：“水始起也，目窠上微肿，如新卧起之状，其颈脉动，时咳，阴股间寒，足胫肿，腹乃大，其水已成矣。以手按其腹，随手而起，如裹水之状，此其候也。”《诸病源候论·水肿候》中首次把“水肿”作为各种水病的总称。汉代的张仲景将水肿称为水气，他在《金匮要略·水气病脉证并治》中以表里上下为纲，将此分为风水、皮水、．正水、石水、黄汗五种类型，具体描述：“风水，其脉自浮，⋯⋯，石水，其脉自沉，外证腹满不喘。"该书又根据五脏的发病机制及证候将水肿分为心水、肝水、肺水、脾水、肾水。宋代严用和首次按阴阳理论把水肿分为阴水、阳水两类，在《济生方·水肿门》说：“肿满最甚于下，当辨其阴阳"，“阴水为病，脉来沉迟，色多青白，不烦不渴，小便涩少而清，大腹多泄⋯⋯阳水为病，脉来沉数，色多黄赤，或烦或渴，小便赤涩，大便多闭。’’明代李梃《医学入门·水肿》提出疮毒至水肿的病因学说。尿浊在《素问·至真要大论》中被称为“溺白”，在《诸病源候论》中 综述被称作“白浊”，在《丹溪心法》中把其分为“赤浊”和“白浊”，在《景岳全书》被称为“遗浊"、“便浊’’，在《杂病源流犀烛》中被成为“二浊"。《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》首次提出了虚劳的病名，并详细的叙述了虚劳的证因脉治，将虚劳分为阴虚、阳虚、阴阳两虚三类。《诸病源候论·虚劳病诸侯》中比较详细的论述了虚劳的病因和各类虚劳的症状，对物劳、六极、七伤的具体内容均做了详细的说明。2．1．2中医MN病因病机认识虽然众多医家对膜性肾病的病机特点各有其独自的见解和认识，但对此病发病的本质“本虚标实”的观点己达成共识【36|。本虚是该病发生的主要矛盾，也是疾病发生发展的基础。众医家认为正虚主要以是肺、脾、肾亏虚为主，而关键在肾【37-391。《景岳全书明中胀》指出：“凡水肿等证，乃肺、脾、肾三脏相干之病，盖水为至阴，故其本在肾；水化于气，故其标在肺；水唯畏土，故其制在脾。今肺虚气不化精而化水，脾虚则土不制水而反克，肾虚则水无所主而妄行。’’肺在上焦，主一身之气，有主治节、通调水道、下输膀胱的作用。实邪犯肺、或肺脏虚损，均可致使肺气失宣降，不能通调水道，而发为水肿。脾居中焦，主运化水湿和水谷精微，有布散水精的功能，为治水之脏。外感水湿、脾阳被困、饮食劳倦等均能损及脾气，脾气亏虚，运化无力，水无所制而泛滥；肾位下焦，为先天之本，主水，为主水之脏，水液的输化有赖于肾阳的蒸化、开阖作用。久病劳欲、或先天禀赋不足，致使肾脏虚损，则肾失蒸化，开阖不利，终致水液泛溢于肌肤，则发为水肿。脾主升清，脾虚不能升清，水谷精微失于输化，不升而下泄；肾藏精，司封藏，肾虚精微失于封藏而外泄，则发为蛋白尿。脾虚日久，后天之本不充；肾虚日久，温煦滋养失职，两者相互影响，致使本病更加缠绵。标实则多表现为水湿、湿热、瘀血等病理性实邪。脾为制水之脏，肾为主水之脏，脾肾亏虚则水无所致、水失所主而致水液失运而成水湿。湿热的产生，多是水湿内停，郁久化热，而致湿热内蕴；湿热已成，困遏中焦，阻碍脾之运化升清，蕴结下焦，影响肾之气化闭藏，终致水湿泛溢、精微下注之势更甚。湿热阻遏气机，使气滞不行，伤津耗气，使气虚津亏；气滞血行不畅，气虚运血无力，津亏生血无源，均可致脉络瘀阻，另外本病病程冗长，“久病必瘀”，瘀血乃成，瘀血又可作为新的致病因素使病情 综述加重。总之，血瘀水停、湿热互结致使本病更加的缠绵，难以治愈。可见，本病虽以脾肾虚损为主，但水湿、湿热、瘀血等既是病变过程中的病理产物，又是促使病变加重、病程迁延及合并其它病症的重要因素。2．2中医药对MN的治疗进展2．2．1辨证论治(分型论治)如阳晓将本病分为四型【40】予以治疗：(1)表现为脾肾阳虚的，治疗上宜用温补脾肾、通阳利水之法，方用真武汤合实脾饮加减；(2)表现为肝肾阴虚的，治疗上宜用滋补肝肾，兼化水湿之法，方用二至丸合杞菊地黄丸加减；(3)表现为血瘀水阻的，治疗上宜用活血利水之法，方用桃红四物汤加味；(4)表现为寒湿侵渍的，治疗上宜用通阳化湿、利水之法，方用五苓散合五皮饮加减。刘宏伟将本病也分为四型【4l】施治：(1)属气阴两虚、湿瘀阻络的，宜用活血清利、益气养阴之法治疗，方用参芪地黄汤加减；(2)属脾气虚弱、水湿停留的，宜用利水渗湿、健脾益气之法治疗，方用参苓白术散加减；(3)属肝肾阴虚、湿热留恋的，宜用滋补肝肾、清利湿热之法治疗，方用知柏地黄汤加减；(4)属脾肾阳虚、水湿泛滥的，宜用温肾健脾、通阳利水之法治疗，方用真武汤合苓桂术甘汤或五苓散加减。余仁欢【42】总结聂莉芳教授在治疗本病的临床实践中，形成了一套以“健脾补肾，活血化湿解毒’’为治疗大法的中医治疗方案：(1)健脾益气和胃法：方用参苓白术丸和香砂六君子汤加减，常用药物有黄芪、党参、白术、陈皮、莲子肉、当归、茯苓、炒薏米、扁豆、芡实、金樱子、砂仁、苏梗、山药等；(2)补肾涩精法：方用参芪地黄汤加减，常用药物有党参、黄芪、生地、山药、萸肉、丹皮、茯苓、泽泻、川牛膝、怀牛膝、丹参、白芍、当归、芡实、金樱子、菟丝子等；(3)活血化瘀法：方用自拟加味当归芍药散加减，常用药物有当归尾、赤白芍、川芎、丹参、白术、茯苓、泽兰叶、川I牛膝、怀牛膝、地龙等；(4)清热解毒法：方用五味消毒饮加减，常用药物有连翘、银花、公英、野菊花、紫花地丁、半枝莲等。陈以平根据该病的病因及临床表现等提出了分期论治的观点【431。早期多为湿热瘀阻证，治宜清利湿热，益气活血，方用陈氏清热膜肾方加减；中后期多为脾肾阳虚型，治宜健脾益肾，温阳活血，方用陈氏补肾膜肾方加减。 综述罗勤总结吴康衡教授治疗本病的经验，将本病分为四型【44】来治疗：(1)湿热内蕴型，治时宜用清热解毒，利湿益肾之法，方用利肾胶囊，药用鱼腥草、白花蛇舌草、萆解、石韦、益母草、木贼、贯众、石菖蒲、芡实。(2)痰瘀互结型，治时宜用散结祛瘀，消痰软坚之法，方用软坚胶囊，药用三棱、莪术、王不留行、白芥子、瓦楞子、水蛭、黄药子。(3)肾阳虚衰型，治时宜用利水消肿，温补肾阳之法，方用安肾胶囊(安肾口服液)，药用附片、肉桂、山茱萸、熟地黄、牡丹皮、淫羊藿、红花、兔丝子、葫芦巴。(4)精血匮竭型，治时宜用益气养血，填精补髓之法，方用滋肾口服液，药用制首乌、桑椹子、生地黄、旱莲草、女贞子、枸杞、牡丹皮、黄芪、党参、鹿角胶。张佩青f45】根据本病的病因病机，以“益气健脾固肾，解毒祛湿通络”为治疗方案，将本病分为三型：(1)脾肾两虚型，宜健脾补肾以培护根本，常用黄芪、党参、山药、茯苓、白术等补益中气；熟地、枸杞、萸肉、旱莲草、女贞子等滋补肾阴，充养肾精；肉桂、附子、菟丝子、威灵仙等温补肾阳，引火归元；金樱子、芡实、山药等使肾气固密，精关稳固。(2)湿热毒邪型，宜清热解毒利湿以祛邪，常用药有重楼、银花、白花蛇舌草、半枝莲、连翘、土茯苓等解毒利湿；黄芩、黄连、栀子清热祛湿；加陈皮、枳实、紫苏、厚朴、榔片使气机通畅而湿热得去。(3)血瘀胶结型，宜活血化瘀以祛胶结，导师认为此为血瘀胶结，临床常用活血化瘀药有水蛭、桃仁、红花、赤芍、益母草、等活血化瘀祛胶结；加黄芪、党参以鼓动正气而推血运；“气行则血行"，加川芎、枳实、厚朴之品疏通气机而活血通络；并常少佐桂枝、肉桂、附子温通经络，使经络通畅，则血行而无滞涩，水液归于脉中，而达到利水之疗效。王琳等[461认为膜性肾病肾小球基底膜上皮下的免疫复合物沉积，应当归属于中医的“湿热胶着成瘀"的微观辨证理论，他们发现本病在发病期，临床表现以脾虚湿热型为主证，单纯运用益气活血、化湿法治疗IMN70例，全程给予清热膜肾冲剂，脾虚湿热型给予陈氏清热膜。肾方，有效率85．71％。大量临床研究证明，中医辨证施治能有效的治疗膜性肾病，尤其对于激素及免疫抑制剂无效或不能使用的患者更是主要的治疗选择。2．2．2专方治疗 综述翟惟凯[471认为膜性肾病肾小球基膜上皮细胞下免疫复合物沉积，用中医微观辨证理论应辩证为“瘀血”，肾小球结构的损伤即是络的损伤。他经过多年临床实践，结合络病理论，认为本病的基本病因病机为脾肾气虚，肾络瘀阻，并创立了以“益气通络”为治疗大法的基本方，其药物组成为：黄芪309，生地159，当归lOg，党参209，赤芍209，水蛭lOg，僵蚕159，三七69，全虫粉19，青风藤159，海风藤159。临证时可见湿，热瘀相互纠集结聚，可加蛇舌草，茯苓，白术等；脾虚不能运化，浮肿甚者，加获等皮，泽泻，大腹皮；气虚日久，阳气亏虚，畏寒怕冷者，加肉桂，巴戟天。黄九香HsI认为，在本病的治疗过程中，要把清热利湿贯彻始终，将清热解毒，利水渗湿作为本病的基本治法。黄氏选用唐·孙思邈的《干金要方》中的泻肾汤加减作为基础方，以清除肾经湿热毒邪，组方如下：黄芩159，酒大黄lOg，白花蛇舌草309，猪苓159，生地309，白茅根309，甘草159。周锦【49】常说，膜性肾病肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物沉积、基底膜增厚从中医微观辨证来讲，归属于中医“瘕积"范畴，此为“瘀血”与它邪纠结而成。本病的基本病机是气虚血瘀、瘾积形成，用补阳还五汤化裁治疗，基本方为：黄芪509，当归lOg，川芎lOg，党参lOg，汉防己129，女贞子lOg，旱莲草lOg，金樱子lOg，芡实lOg，赤芍lOg，白术lOg，茯苓lOg，猪苓lOg，佛手99，泽兰159，葫芦壳159，赤d,豆159。叶任高【50】在治疗本病时，以益气健脾补肾、活血化瘀祛湿的“益肾活血汤”治疗，益气活血汤药物组成：黄芪309，党参159，白术lOg，萸肉lOg，茯苓209，车前子159，石韦159，丹参lOg，当归159，赤芍lOg，川芎lOg。诸药合用既治本虚，又兼治标，有利于改善肾脏局部的血液循环，增加肝脏对白蛋白的合成，减少尿中蛋白的漏出。陈以平【5l】教授在观察中医方案治疗特发性膜性肾病的有效性与安全性研究中，用参芪膜肾颗粒作为基础方治疗特发性膜性肾病。湿热较重者，加清热膜肾冲剂；兼肾气虚者，加固肾颗粒；兼肾阳虚者，加益肾颗粒；兼脾虚腹泻者加补脾益肠丸；兼低蛋白血症或严重浮肿者，加黑料豆颗粒；严重水肿者予黄芪注射液。结果显示此方可以有效的降低尿蛋白，提升血浆白蛋白，保护肾功能。综上所述，膜性肾病的临床和实验研究确己取得了较大的进展，充分 综述证明了中医治疗膜性肾病的疗效是肯定的，可是同时也存在了不少的问题：辨证分型及疗效评定的标准不统一。以后应该进一步研究，并制定出一个统一的分型及疗效评定的标准，使中医中药的优势得到充分的发挥，中药复方及其配伍的科学性临床研究已经得到证实，但如何深化中药复方的研究，如何使之更具有说服力，是今后研究的方向，也是中药走向国际、造福人类的关键。2．2．3中西医结合治疗赵文玉【52】等将62例原发性膜性肾病的患者随机分为两组，对照组(，30例)予强的松联合环磷酰胺治疗，治疗组(32例)在对照组治疗的基础上给予中药治疗。在使用激素治疗的初始阶段：应用滋阴降火汤治疗，药物组成：女贞子109、旱莲草129、知母129、生地259、黄柏99、丹皮99、甘草69。若有湿热者加车前草129，石韦159；热毒盛者加银花159、板蓝根159。激素治疗的减量阶段：用六味地黄汤加减治疗，另外，自拟肾特康胶囊：党参、黄芪、白术、补骨脂、枸杞子等常规量。在激素治疗维持量阶段：对于易感之人，常在上述方剂中加玉屏风散(黄芪159，白术109，防风69)配合治疗；有热毒或湿热证者，宜在方剂中加用银花、板蓝根、蒲公英、黄柏、石韦等清热解毒、利湿之品。该阶段可随激素逐渐减量而逐渐增加补气温肾药：生地159、萸肉69、丹皮99、茯苓99、党参159、黄芪159、补骨J]旨'109，有助于减少机体对激素的依赖，防止疾病反跳。使用CTX时：如若患者出现血WBC减少，在主方中加入鸡血藤159，当归109以养血生血。结果显示：治疗组总有效率为87．5％，显著高于对照组63．3％。治疗组治疗后24h尿蛋白定量、血浆白蛋白及纤维蛋白原均得到明显改善，有非常显著性差异。冼启经[531采用活血化瘀法治疗本病，将46例IMN患者随机分为两组，对照组采用糖皮质激素+他克莫司，治疗组在对照组的基础上再应用以活血化瘀利水为法的基础汤方：当归109，』i19159，桃仁159，红花159，赤芍159，大腹皮209，茯苓159，泽泻159，地龙109，丹参159。热毒较重者，加野菊花159，蒲公英159，金银花159。脾肾阳虚者，加附子109，黄芪309，白术159，陈皮59；水肿较重者，加猪苓159，玉米须309，苍术109，薏苡仁309。结果显示：治疗组的患者在治愈好转率，PLT、凝血功能指标以及血脂、血浆白蛋白和尿蛋白水平的改善均优于对照组，二组比较有明显 综述葶巴左升。李秋芬【54J认为本病的主要病机是气虚血瘀，所以在治疗时应用补阳还五汤结合激素和细胞毒药物等治疗本病32例，总有效率高达87．5％。此外，在膜性肾病时患者的高凝状态尤其显著，容易有血栓形成，所以在治疗本病时活血化瘀法占着举足轻重的作用。文平凡[551将27例I～II期膜性肾病患者随机分为两组，对照组13例给予西医常规治疗，治疗组14例在西医常规治疗的同时给予益肾固卫汤治疗，益肾固卫汤药物组成：黄芪309，肉桂109，熟附片109，生地159，萸肉159，白术109，山药209，茯苓159，丹皮159，防风159。血瘀重者加当归109，坤草309，桃仁109；兼有水湿者加玉米须309，土茯苓209，薏米309，大黄59。3个月后评价临床疗效。结果显示：总有效率治疗组85．7％、对照组76．9％，两组比较有显著性差异俨