第五章 酶分子修饰

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1、第五章酶分子修饰酶化学修饰的目的酶化学修饰的种类及应用第一节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因：1)细胞外稳定性差；2)酶活性不够高；3)具有抗原性。2.改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。二、酶化学修饰的目的（一）研究酶的结构与功能的关系。（二）人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。1.修饰酶的热稳定性2.修饰酶的抗原性3.修饰酶对各类失活因子的抵抗力4.修饰酶在体内的半衰期5.最适

2、pH第二节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广的酶分子修饰方法。1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。2.修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修饰方法：修饰前活化（P139），然后在一定条件下与酶分子共价结合。3.应用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）延长了酶在体内的半衰期（P141表5-1

3、）又如：PEG－天冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性提高酶活（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺各种氨基酸侧链的

4、修饰剂（三）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰通常采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高

5、。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。应用实例：1）酶原激活a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活2）提高酶活力：天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰。从羧基端切除10个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5倍左右。3）消除抗原性：（抗原性还与分子大小有关）木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其肽链的2/3，该酶的活力基本保持。其抗原性却大大降低。（二）氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。氨

6、基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作

7、技术。酶分子的定点突变1、新酶分子结构的设计2、突变基因碱基序列的确定3、引物设计进行基因定点突变4、酶基因克隆表达5、变异特性分析（三）金属离子置换修饰改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。常用金属离子（往往是二价离子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。方法步

8、骤：酶的分离纯化－向酶液加入一定量的EDTA－将酶与金属螯合物分离－金属离子置换。举例：α-淀粉酶发酵生产、保存和应用过程中添加一定量的钙离子。（四）核苷酸链剪切修饰在核苷酸链的特定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的特性和功能的方法。RNA核酸类酶除去一部分核苷酸残基（无催化活性）5’GAG3’G-IVS