第五章：(酶工程) 酶分子修饰

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1、第五章酶分子修饰酶的活性中心酶化学修饰的目的酶化学修饰的原理酶化学修饰的设计酶化学修饰的种类及应用第一节酶的活性中心（activesite）一、活性中心的概念由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.二、活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一个三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。ActivesiteTheactivesiteistheregionoftheenzymethatbindsthesubstrat

2、e,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.Theactivesiteisathree-dimensionalentity,oftenacleftorcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.三、研究酶活性中心的方法1.物理学方法：用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为1)非专一性化学修

3、饰用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。活性中心基团的鉴定标准①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。差别标记：底物或抑制剂存在活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂原来被保护的基团带同位素标记可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。化学修饰含同位素标记的同样试剂2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。3)亲和标记（位点专一性修饰）

4、采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。化学修饰的专一性亲和修饰剂：①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。3.蛋白质工程：（定点诱变法）将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。第二节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因：1)细胞外稳定性差；2)酶活性不够高；3)具有抗原性

5、。2.改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。二、酶化学修饰的目的（一）研究酶的结构与功能的关系。（二）人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。1.修饰酶的热稳定性2.修饰酶的抗原性3.修饰酶对各类失活因子的抵抗力4.修饰酶在体内的半衰期5.最适pH6.Km的变化第三节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或

6、静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。第四

7、节酶化学修饰的设计一、充分认识酶分子的特性包括酶的——1.活性部位情况2.稳定条件及反应最佳条件3.侧链基团的化学性质及反应活泼性二、修饰剂的选择要考虑——1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件三、反应条件的选择要注意——1.酶与修饰剂的分子比例2.反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件3.反应温度及时间第五节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广