大鼠颌下腺细胞与含血管内皮生长因子(vegf)的丝素-壳聚糖支架体外复合培养的实验研究

《大鼠颌下腺细胞与含血管内皮生长因子(vegf)的丝素-壳聚糖支架体外复合培养的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、大鼠颂下腺细胞与含血管内皮生长因子（VEGF）的丝素-壳聚糖支架体外复合培养的实验研宄才越1谭学新2（通讯作者）（1屮国医科大学门腔医学院门腔颂面外科教研室辽宁沈阳110001）（2屮国医科大学门腔医学院门腔颂面外科教研室屮国医科大学门腔医学院解剖生理教研室辽宁沈阳110001）【摘要】目的研究含血管内皮生长因子（VEGF）的丝素-壳聚糖支架（Silkfibroin-chitosanscaffcold）对大鼠颌卜腺细胞（RatsubmandibularglandcellsRSGCs）粘附、增殖、分泌作用的影响。方法应用体外组织块法原代培养3d龄Wis

2、tar大鼠的颂卜腺细胞，免疫组织化学法鉴定来源、胰酶消化法和差速贴壁法纯化、传代扩增。冻干技术制作含VEGF的丝素-壳聚糖支架作为实验组，不含VEGF的丝素-壳聚糖支架作为对照组。用作实验组的每个支架含VEGF浓度为10ng/ml。将浓度为5.0×106/ml的第二代火鼠颌卜腺细胞悬浊液分别接种于含有VEGF的丝素-壳聚糖支架（实验组）和不含VEGF的丝素-壳聚糖支架（对照组）进行培养。测定实验组和对照组的人鼠颌下腺细胞的粘附率，免疫组化法鉴定细胞來源。免疫荧光法观察细胞在支架上的生长情况，MTT法检测接种后实验组和对照组的大鼠颌丁腺细胞

3、增殖情况。扫描电镜观察接种大鼠颌不腺细胞在支架上生长的超微结构。测定ld-9d培养复合物上清液屮淀粉酶含量，检测实验组和对照组的大鼠颌K腺细胞分泌功能。采用SPSSforwindows13.0统计分析软件对结果进行方差分析，检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。结果将纯化扩增的大鼠颂卜腺细胞与含VEGF的丝素-壳聚糖支架和不含VEGF的丝素_壳聚糖支架成功的复合培养。细胞粘附率检测：实验组粘附率高于对照组。细胞増殖结果显示（MTT法）：接种后ld，实验组细胞数量略大于对照组（P〉0.05）,而3d-9d,两组支架上的细胞数量有显

4、著性差异（P<0.05）,实验组优于对照组。细胞上清液屮淀粉酶含量检测：从3d-9d实验组优于对照组，淀粉酶含量差异有统计学意义(P<0.05)。扫描电子显微镜观察：丝素-壳聚糖支架呈海绵状结构，植入初期大鼠颌下腺细胞成圆形，散在的粘附于丝素-壳聚糖支架网孔内，随着时间的延长，实验组大鼠颂下腺细胞生长情况明显优于对照组。结论含血管内皮生长因子的丝素-壳聚糖支架对大鼠的颂下腺细胞的粘附、增殖、分泌奋促进作用。【关键词】大鼠颂下腺细胞丝素-壳聚糖支架血管内皮生长因子涎腺的分功能障碍是临床上一个常见的问题，组织工程化颌下腺，是将体外颌下腺细胞和

5、支架材料复合培养后植入到体内，在体内生长发育，逐渐形成预定的颂下腺组织的方法。血管内皮生长因子是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，诱导血管新生，0前己有血管内皮生长因子应用于U腔颂面部骨组织工程中的相关报导。在支架中添加生物化学信号，使支架能够引导细胞功能对组织工程是非常冇价值的。本实验意在研究含VEGF丝素-壳聚糖对人鼠颌下腺细胞粘附、增殖、分泌的影响，与构建功能性的组织工程化颌下腺奠定基础。材料与方法一、实验材料3d龄的Wistar大鼠;胎牛血清；DMEM培养基；CK8抗体；VEGF；淀粉酶试剂盒；蚕茧；壳聚糖；C02培养箱；OLYMPUS倒

6、置显微镜及照相系统；扫描电子显微镜；0.25%(w/v)的碳酸钠、十二烷基硫酸钠溶液；50%氯化钙溶液；1%壳聚糖溶液：壳聚糖；VEGF溶液；MTT。二、实验方法1、Wistar大鼠颌下腺细胞的培养3d龄Wistar大鼠溺死，完全浸泡于碘伏中消毒5min。超净工作台内，完整的取出颂下腺。把大鼠颂下腺移入无菌培养皿中，加入少许PBS液，将细胞剪碎成糊状，使用PBS液冲洗两遍。在无菌塑料培养瓶中加几滴10%胎牛血清，并使其均匀铺一薄层于瓶底部，37"C培养箱中孵育5min，将剪成糊状的颌下腺组织块，平铺于25cm2塑料培养瓶底部，每瓶的组织块量大约为2只

7、鼠来源的颂下腺。轻轻翻转、倒置培养瓶，在C02培养箱中，37°C,5%CO2,饱合湿度条件下孵育2h,待组织块贴壁，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，刚好浸过组织块为可。正置培养瓶，放入C02培养箱，24h后补加培养液lml,继续培养。24h第一次换液，以后隔Id换1次液，使用含10%胎牛血清DMEM/F12培养基，前几次量为l-2ml,生长旺盛吋可加3-4mL倒置显微镜下观察，当组织块边缘游出的细胞增多密集到一定程度，进行如下步骤：轻摇培养瓶数次，悬浮起未贴壁的组织块或组织碎片，连冋培养液一起倒掉。从无细胞面加入0.25%胰蛋白酶lm

8、l,正置培养瓶使消化液浸没细胞,倒置显微镜下观察，当成纤维细胞变圆吋，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12