环介导恒温扩增技术在食品检测中的应用

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1、环介导恒温扩增技术在食品检测中的应用麵李明生西北民族大学生命科学与工程学院西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研宄中心西北民族大学实验中心摘要：食品安全问题是每个人关注的问题，为了维护消费者的利益，提高生活质量，实现监管部门对食品质量的现场快速检测是十分有必要的。环介导恒温扩增技术以核酸为靶标进行有效扩增，具有高特异性、高灵敏度、快速且高效等特点，因此针对食品的快速检测具有一定的可操作意义。本文针对环介导恒温扩增技术的概要以及在食品领域的掺假问题、转基因成分的检测和食源性病原菌检测等方面进行了综述，以期为食品领域的现场快速检测

2、提供一定的理论基础。关键词：环介导恒温扩增技术;食品安全;现场检测;作者简介：赵彩红（1994-）,女，四川遂宁人，在读本科生，主耍从事食品检测技术研究。作者简介：徐红伟（1983-）,男，甘肃积石山人，硕士，主要从事动物营养与饲料研宄。收稿日期：2017-07-19基金：科技部援助项目（KY201501005）Received：2017-07-19舌尖上的中国日益火爆，舌尖上的安全隐患也越来越严重。近年来，一系列食物屮毒、致病性微生物含量超标等食品安全事件频繁爆发，诸如2006年的苏丹红鸭蛋事件、2008年三聚氰胺奶粉事件

3、以及频繁爆发的地沟油事件跟2011年的痩肉精事件等。在分子生物学高速发展的今天，如何能快速、有效的进行食品检测己成为监管部门以及基层管理者的难题。环介导恒温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification)是由日本学者Notomi2000年在NucleicAcidsRes杂志上公开的一种新型的基因诊断技术。经过十几年的发展，目前在大量报道中，环介导恒温扩增技术以高特异性、高灵敏度、操作简单、耗时短、结果易于鉴定等特点而著称，已被广泛的用于病原体［1-3］＞植物［4-5］等研究领域，成为分子生

4、物学研究领域的新兴技术。该技术在食品检测方面也有了很大进展，包括掺假问题，病原菌的检测、转基因食品检测等。1环介导恒温扩增技术的概况环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP),其持点是针对靶基因3‘端的Flc，F2c,F3c以及5‘端的Bl，B2,B3这6个区域,设计4种特异性引物，分别是两对内引物(FIP和BIP)以及两对外引物(F3和B3),在Bst链置换酶(BstDNApolymerase)的作用下进行恒温高效扩增。通过聚合酶链式反应(polymerasec

5、hainreaction,PCR)可知，DNA的扩增需要经过变性、退火以及延伸3个阶段，而在6(T65°C范围

6、Aj，DNA双链处于动态的复性与延仲阶段，能进行DNA的扩增。LAMP反应一共经过三个阶段，分别是起始阶段，循环扩增阶段和延伸阶段。所谓起始阶段便是形成哑铃状模板。反应过程为：当内引物FIP与模板DNA结合延伸时，外引物F3也与该模板结合，在Bst链置换酶的作用下，由FTP引物合成的链被置换下来并通过碱棊自我配对形成环状，同时，N引物BIP以该置换链为模板，将环状打开，B3又以该链为模板，在Bst酶的作用下，合成另

7、一条链解离，并碱基自我配对形成哑铃状模板。起始阶段完成后，反应体系以该哑铃状模板为起始模板，通过两条内引物(FIP和BIP)与模板的不断重复结合、置换、解离进行再循环扩增以及延伸，3(f60niin后，就能产生火量的具冇多重茎环结构的产物，扩增量可达到109~1010个数量级，高于PCR的扩增数量级［6］。LAMP技术自发明以来，就被广泛的报道有特异性强、灵敏度高、扩增效率高以及省时、简便等特点。LAMP技术是针对靶基因的六个区域设计四对引物，与PCR技术的两个区域的两对引物相比，其特异性极高。陈传m等人采用普通PCR技术与

8、LAMP技术在对霍乱弧菌进行比较得知，LAMP反应在65°C条件下扩増60min检出限为10，而普通PCR需耍在昂贵的热循环仪的辅助下其检出限低于LAMP技术100倍，这表明LAMP技术高效且灵敏。LAMP技术的扩增不需要热循环仪，一个水浴锅就能完成反应，且在DNA合成时，有大量的白色的焦磷酸镁沉淀生成，以浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。还可以LAMP凝胶电泳检测时观察到梯状条带，最为简便的检测方法是在反应产物中添加荧光染料(SYBRGreenI)混匀后直接用肉

9、眼判定结果，当颜色变绿即是发生扩增反成，反之为橙色。RavindranA_［^_等人在检测土豆和木瓜中的“CandidatusLiberibactersolanacearum”病原菌时，将LAMP扩增产物的结果采用四种方法进行验证，分别为观察浑浊度、加MnCl2以及钙黄绿素与反应液混匀后在