二代测序技术在医学领域中的应用

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1、二代测序技术在医学领域中的应用魏冬凯概要二代测序技术简介常见医学领域NGS方案石蜡包埋样本解决方案CTC和ctDNA二代测序技术简介人类基因组HumanGenome30亿对碱基来自母亲30亿对碱基来自父亲线粒体基因组来自母亲与人类共生的微生物基因组DNA的构成末端终止法测序ABI3700(ABI3730)人类基因组计划(HGP)人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元

2、的人类基因组计划。按照这个计划的设想，最终要把人体内约4万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。被誉为生命科学的“登月计划”。CeleraGenomicsCraigVenter成立第一个使用全基因组鸟枪法测序使用330台ABI3700，购买当时世界排名第三的服务器进行运算，花费3个月时间对Venter的基因组进行测序，得到20GB数据。Ventor基因组测序基于分子克隆，必须将DNA

3、片段克隆至大肠杆菌中，否则无法测序。每次末端终止反应体系10ul，其中含有1013个DNA分子，但每次只能测其中1条。预计花费2亿美金，最终花费30亿美金！怎样才能降低试剂消耗？降低消耗的办法1.将分子克隆替换成聚合酶链式反应（PCR），先给DNA片段加上尾巴。桥式PCR2.降低反应体积把测序反应装到小的空间里去。10ul的试剂做更多的DNA测序反应。降低消耗的办法1.将分子克隆替换成聚合酶链式反应（PCR），先给DNA片段加上尾巴。桥式PCR2.降低反应体积把测序反应装到小的空间里去。10ul的试剂做更多的DNA测

4、序反应。桥式PCR二代测序（NGS）边合成边测序（SBS）FlowcellSBS技术特点读长最初的时候只有31bp，现已能达到600bp。运行时间长，荧光信号会逐渐减弱。每次只能结合1个碱基，发出一种荧光信号。Hiseq2500可同时运行2张8通道flowcell有高通量模式和快速模式2种模式。单次运行数据量高达500GB。快速模式最短运行时间17小时。常见医学领域NGS方案二代测序应用医疗的可行性NGS的优势相比于一代测序，NGS更加省时低成本，速度快，覆盖度深，准确度高；高通量测序人类基因组有助于发现与疾病相关的

5、未知基因；对于疾病引起的基因突变，高通量测序可以为患者医师提供更为准确的诊断依据；需求样本类型广泛，样本量需求少。常见医学领域NGS方案全基因组重测序（WGRS）寻找个体突变，InDel，CNV，SV等等，需求数据量大，单个样本需求90G数据。全外显子组测序（WES）捕获基因组中的全外显子进行测序，测序数据量较WGRS少很多，并能获得高测序深度（50X-150X）常见医学领域NGS方案靶向区域测序（TargetSequencing）捕获富集感兴趣的靶向区域进行测序，技术流程与全外显子捕获相似，测序需求量较WES少，能

6、获得更高测序深度（最高500X）转录组测序（RNA-Seq）研究转录水平上的测序，包括mRNA，lncRNA，microRNA等。全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。全基因组重测序(WGRS

7、/DNA-Seq)SNP（个体间差异）CNV（大片段基因拷贝数变异）InDelSV（结构变异）全基因组重测序的应用SNP(SNV)示例为何研究SNP？SNP目前已被公认为疾病发生的基因分子标记。SNP被认为是导致药物差异化的主要因素之一，因此可以根据SNP的变化来进行个性化用药。SNP分布广泛，且较为稳定。某些SNP会直接影响功能基因表达。大多数的SNP都是无用的大多数的SNP属于沉默突变。非编码区的错义突变也不会导致蛋白质发生改变。但也有例外诊断实例：Dr.JamesGern和JosephDeRisi合作，用MiS

8、eqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。Dr.JamesGern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中