二代测序技术的原理与应用.pptx

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1、二代测序技术的原理与应用测序技术的发展历程核酸基本知识核酸基本知识-PCR聚合酶链式反应—PolymeraseChainReaction1983Mullis获得1993年的诺贝尔化学奖TaqDNA聚合酶、引物、dNTP、模板和Mg2+第一代测序技术-sanger法测序第一代测序技术-sanger法测序底物:模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物变性-复性-延伸-终止ddNTP可以当作正常碱基参与复制,一旦链入DNA中,其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4:1)。第二代

2、测序技术高通量测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性主流平台Ilumina(Solexa,Hiseq);Roche454;ABI(Solid)测序原理合成法测序连接法测序第二代测序的基本流程1将目标DNA剪切为小片段2单个小片段DNA分子结合到固相表面3单分子独立扩增4每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号5高分辨率的成像系统二代测序技术-可逆阻断技术二代测序技术-Ilumina测序原理二代测序技术-Ilumina测序流程二代测序技术-Ilumina测序流程焦磷酸测序(Pyroseq

3、uencing)在测序时,使用了一种叫做“PicoTiterPlate”(PTP)的平板,它含有160多万个由光纤组成的孔,孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时,放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下,经过一个合成反应和一个化学发光反应,最终将荧光素氧化成氧化荧光素,同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子

4、的光信号;由此一一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。二代测序技术-454测序原理二代测序技术-454测序流程二代测序技术-Solid测序流程二代测序技术-Solid测序流程二代测序技术-Solid测序数据分析第X代公司平台名称测序方法检测方法大约读长(碱基数)优点相对局限性第一代ABI/生命技术公司3130xL-3730xL桑格-毛细管电泳测序法荧光/光学600-1000高读长，准确度一次性达标率高，能很好处理重复序列和多聚序列通量低；样品制备成本高，使之难以做大量的平行测序第一代贝克曼GeXP遗传分析系统桑格-

5、毛细管电泳测序法荧光/光学600-1000高读长，准确度一次性达标率高，能很好处理重复序列和多聚序列；易小型化通量低；单个样品的制备成本相对较高第二代Roche/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵第二代IlluminaHiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序通量仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用很高第二代ABI/Solid550

6、0xlSolid系统连接测序法荧光/光学25-35很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵测序技术的比较SNP的概念单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达3

7、00万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，也就是通常说的基因的点突变，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP（codingSNP,cSNP）比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5.但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更

8、受关注。SNP的应用1.寻找致病基因遗传疾病中已发现SNP的例子，如镰刀形细胞贫血症、晚期突发老年性痴呆等2.诊断及预测致病风险3.药物基因体学及新药的发现临床治疗实践清楚地表明，药物的有效剂量有著极大的个体差异，可以视为一种基因的表型4.生物芯片快速检测第二代测序技术的应用