模拟微重力对骨髓间充质干细胞全细胞瘤苗干预a549移植瘤增殖的研究

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1、模拟微重力对骨髓间充质干细胞全细胞瘤苗干预A549移植瘤增殖的研究［摘要］目的比较骨髓间充质干细胞（MSCs）于不同重力环境下获得全细胞抗原（WCAs）对于人肺腺癌细胞株A549荷瘤的影响。方法全骨髓贴壁法原代培养小鼠MSCs，采用2D回转模式，以30r/min水平回转模拟微重力（画G）培养条件，并以正常重力（NG）为对照培养MSCs；随后以15Gy的X线灭活MSCs获取WCAs，将BALB/c小鼠随机分成4组，实验组（MMG组）皮下接种WCAs为（1次/3d，共2周）；对照组分别为PBS组，NG组，A549组；各组均采用A549细胞系皮下移

2、植荷瘤，观察4组小鼠肿瘤生长情况；测量肿瘤直径、计算肿瘤体积，并采用免疫组化法检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达。结果肺腺癌A549细胞皮下移植使小鼠成功荷瘤，丽G可促进WCAs抑制移植瘤的生长。组肿瘤体积显著小于PBS组与NG组（P[Keywords]Mesenchymalstemcells；Cancer；Modeledmicrogravity有关肿瘤发生“胚胎”属性的认识由来已久，“cancer”源于古希腊语，意味着“anaplasia（返祖）”，其内涵就是“tofrombackwards（回到起点）”。去分化（dedifferentia

3、tion）属性，指某种情况下，一些细胞失去它原本所在组织的结构和功能，成为一个具有未分化细胞特征的细胞，而具备这种特性的细胞往往都是肿瘤细胞［1］。正是基于此设想，一百多年来，研究人员尝试采用胚胎组织进行裂解获得瘤苗抗原，评估其对移植瘤抑瘤效果并取得初步结论［2］，即干细胞或胚胎组织的粗抗原可产生类似肿瘤疫苗的作用。本研究组早前也初步摸索，发现骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）获得全细胞抗原（wholecellantigens,WCAs）可以产生抑瘤作用［3-4］o进一步评估发现，通常条件下MSCs瘤苗的抑

4、瘤效率低，这可能将成为制约瓶颈有待突破。因此，探索可以提高全细胞瘤苗免疫原性的方法或策略显得尤为迫切。本研究采用模拟微重力（MMG）干预MSCs全细胞抗原后进行免疫接种，评估比较不同重力模式下MSCs的WCAs的抑瘤作用。1材料与方法1.1实验材料BALB/c系小鼠（合格证号：军KS-2012-0004，军事医学科院动物中心）；C02恒温培养箱（Thermo140型，美国HERAcell）,普通离心机（HDL-40B型，成都科学仪器厂），2D回转仪（中国科学院），台式低温高速离心机（Labofuge400R型号，德国Heraeus）,倒置显微

5、镜（CKX31型，日本Olympus）；低糖DMEM（美国Hyclone）,胎牛血清（美国Hyclone），PCNA-鼠单抗（美国Abcom），辣根过氧化物酶（HRP）-二抗（北京中杉公司）。1.2方法1.2.1MSCs、A549培养与全细胞抗原的制备1.2.1.1MSCs全骨髓贴壁法培养MSCs,6周龄小鼠的股骨和胫骨，10%FBS-低糖DMEM冲出骨髓，接种于培养瓶里，24〜48h后去悬浮，每3〜4天换液，直至需要传代。1.2.1.2人肺腺癌A549细胞从液氮罐中取出A549细胞冻存管，放入37°C水浴锅中解冻，lOOOir/min离心5

6、min，PBS吹打、离心后，以1O%FBS+5°/oRPMI-164O培养，2〜3d换液，直到需要传代。1.3MSCs全细胞抗原制备X线照射裂解法获得抗原，调整3〜5代A549细胞密度为1X106，于培养皿中行X线照射，强度为15Gy，时间30s;照射后的抗原4°C保存不超过6h。1.2.2CCK8细胞活力检测在96孔板中接种浓度为2X104个/孔的2种细胞（MMG与NG分别培养的MSCs）悬液，置于培养箱中预培养（37°C，5%C02）；接种细胞后分别于第3、6、9、12天加入10yLCCK8溶液；培养箱内孵育2h;酶标仪测定在450nm处

7、的吸光度。1.2.1MMG干预采用2D回转模拟微重力培养条件［5-6］，MSCs细胞分为丽G组与正常重力（NG）对照组，丽G组细胞上回转仪上模拟失重（经计算以30r/min为最佳效果），在此回转条件下重力及切应力对细胞产生的影响会降至最低［7］。MSCs长至融合后，消化细胞接种于盖玻片上，随后置于6孔培养板中，调整细胞密度为2X105个/孔；贴壁后上回转仓，将爬片插入到特制的Fixing铁架上，每个铁架相应放入4个玻片，置于小室，加入培养基（37°C，10%低糖DMEM）;拧紧盖子安装至回转器上，整个回转系统放置在37°C恒温培养箱，以30r

8、/min旋转回转48h。NG对照组所有操作相同，即师片后入小室，但小室不上回转器。1.2.4移植瘤荷瘤造模及实验分组选择3〜4周龄雄性小鼠，每组6只。依据免疫应激抗