抗hbsag人源抗体fab片段原核表达的优化

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1、抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化：焦永军,曾晓燕,史智扬,汪华,崔仑标,龚希萍,薛蓉,周镇先【摘要】　　目的:优化抗HBsAg人源抗体片段hFabHB1在大肠杆菌中功能性表达的条件。方法:通过测定宿主菌培养物A600值观察10g/L的葡萄糖对宿主菌生长的影响;比较诱导前是否更换培养液的2种不同条件hFabHB1的表达产量;比较在37℃和25℃2种诱导温度下功能性hFabHB1分子的表达量以及Fd和轻链表达的平衡性。大量表达的功能性hFabHB1分子经亲和层析纯化后,用ELISA鉴定其生物活性。结果:在培养液中加入10g/L的葡

2、萄糖可有效抑制重组蛋白的本底表达,增加宿主菌的生长速度;在加入IPTG诱导前更换培养液可明显提高hFabHB1的表达产量;25℃的诱导温度比37℃能表达更多的功能性Fab分子,并且Fd和轻链表达量也更趋于平衡。经亲和层析纯化的hFabHB1分子可与HBsAg特异性结合。结论:实验结果为在原核系统中大量表达该抗体片段提供了技术储备。【关键词】抗HBsAg人源抗体hFabHB1原核表达优化　　乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是一类严重危害人体健康的感染性疾病,全球约有3.5亿人感染乙肝病毒（HBV）,其中近10%的患者可因持续感染导致肝硬化或肝细胞

3、癌[1]。针对HBsAg的中和抗体可阻断乙肝病毒对肝细胞的吸附,从而避免了病毒攻击。目前HBsAg的中和抗体作为免疫治疗剂已在临床上广泛使用,如对HBsAg阳性产妇生产的新生儿进行抗体的被动免疫,以阻断母婴垂直传播[2];对肝移植的乙肝患者进行抗体的紧急接种来保护移植肝组织免受病毒感染等[3]。但目前使用的抗体均来自人血清,价格贵,有限,且存在其他病原体感染的潜在威胁[2]。hFabHB1是通过基因工程技术,从HBV免疫型噬菌体抗体文库中筛选的全人源Fab型抗体片段分子,其靶分子是HBVHBsAg,实验证实hFabHB1可有效阻止HBV与

4、人原代肝细胞的结合,是一个具有潜在临床应用价值的候选分子。但hFabHB1在原核表达系统中存在问题,主要表现在,组成Fab分子的重链Fd段和轻链大多只能以包涵体形式表达,形成有功能的Fab异二聚体分子较少,并且Fd和轻链表达量失衡,轻链大于Fd。本研究对影响hFabHB1功能性表达的各类因素进行优化,如抑制宿主细菌的本底表达、在诱导前更换培养液、降低诱导温度等,使其最终表达产量达到20mg/L。　　1材料和方法　　1.1材料重组质粒pb3xhFabHB1为从噬菌体抗体库中筛出的、能特异性与HBsAg结合的抗体克隆;大肠杆菌表达菌株Top

5、10F′购自Invitrogen公司;ProteinL柱填料购自Pierce公司,HRP标记的山羊抗人IgG（Fab特异性）抗体购自Sigma公司;HBsAg由深圳康泰股份有限公司赠送。　　1.2方法　　1.2.1葡萄糖对宿主细菌生长的影响重组质粒pb3xhFabHB1转化Top10F′化学感受态细胞,挑单菌落置10mLLB培养液（含100mg/L氨苄青霉素,AmpR）37℃250r/min培养过夜。次日用50mLLB培养液（100mg/LAmpR）1∶100稀释过夜培养物,平均分成A、B2份,在A中加入终浓度为10g/L的葡萄糖,B中

6、不加。A、B2份同时在37℃、250r/min培养,每2h测A600值,共培养8h。　　1.2.2诱导前更换培养液对表达产量的影响用50mLLB培养液（含有100mg/LAmpR和10g/L的葡萄糖）1∶100稀释过夜培养物,平均分成A、B2份,37℃培养约6h至A600值=1.0,对A,1500g离心10min,然后用同等体积的新鲜LB培养液（含有100mg/LAmpR）重悬,对B不做处理。在A、B中同时分别加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃诱导3h。取80μL培养物,加入20μL5×还原型loadingbuffer,100℃

7、煮沸10min。样品经瞬时离心后,每个样品上样5μL行LLB培养液（含有100mg/LAmpR和10g/L的葡萄糖）1∶100稀释过夜培养物,37℃培养约6h至A600值=1.0,更换培养液,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,平均分成A、B2份,它们分别在37℃和25℃诱导12h。取1mL培养物,10000g离心2min,取80μL表达上清,加入20μL5×非还原型loadingbuffer,混匀,不煮沸。另取80μL表达上清,加入20μL5×还原型loadingbuffer,混匀,100℃煮沸10min。每个样品上样5μL行LLB培

8、养液（含有100mg/LAmpR和10g/L的葡萄糖）1∶100稀释过夜培养物,37℃培养约6h至A600值=1.0,更换培养液,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,25℃诱导过夜。5000