人源性抗角蛋白单链抗体构建、表达和fab片段生物学作用及其分子机理的研究

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1、第四军医大学博士学位论文!人源性抗角蛋白单链抗体的构建、表达和Fab片段生物学作用及其分子机理的研究研究生李承新指导教师刘玉峰教授第四军医大学西京医院皮肤科·西安，710032中文摘要，(天然自身抗体(naturalautoantibody,NAA)的研究表明，人体免疫系统中天然存在着一个庞大而复杂的自身抗体网络。包括AKautoAb在内，迄今已经发现并证实的NAA有数百种，如抗MHC、RBC、DNA、转铁蛋白、脂类和多糖的抗体以及Jeme免疫调节网络中的抗独特型抗体(anti．idiotypeantibody)等。NAA在体内存在的意义目前

2、尚未完全阐明，但国内外学者已经逐渐摒弃了过去把自身抗体一律当成“可怕的自身毒素”的看法，认识到NAA是机体正常免疫调节机制中重要的也是不可缺少的组成部分，积极参与了免疫系统自身稳定的调节。天然抗角蛋白自身抗体(anti．keratinautoantibody,AKautoAb)，NAA家族成员之一，其作用对象是表皮角质形成细胞(keratinocyte，KC)内的张力纤维细丝。因此，AKautoAb在皮肤病中的生理及病理意义引起许多皮肤科学者的关注，并进行了较为全面的研究。Kro出于1970年最初发现AKautoAb，在80年代末及90年代初

3、，国际上许多学者围绕AKautoAb做了大量工作，如1watsuki等发现未经任何免疫处理的小鼠脾细胞可自发地产生AKautoAb、Hinmer的体外实验间接地发现AKautoAb可以促进单核巨噬细胞对角蛋白凝集物的吞噬。但由于未能得到纯化的AKautoAb，使该领域的研究一度进展不大。我们曾采用亲和层析的方法成功地自正常人血清中纯化了AKautoAb，并进一步发现，AKautoAb能够抑制培养KC的增殖代谢，可以抑制KC产生免疫介质如IL．6、IL培，促进KC凋亡。动物实验还表明，AKautoAb可以加快皮炎的康复，促进银屑病样皮损的消退，

4、显示了其良好的应用前景。但是，纯化的AKautoAb在l临床上的应用由于其来源于人的血液而受到第四军医大掌博士掌位论文!诸多限制，而且，由于角蛋白是分子量在48～68KD之间的一组分子，我们自正常人血清中所提取纯化的AKautoAb也是针对这一组分子量不同的角蛋白的多克隆抗体，这就使研究中的AKautoAb作用特异性较差，无法明确AKautoAb的作用究竟是源于针对某一特定角蛋白抗体的单独作用，还是多种抗角蛋白抗体的综合作用。因此，既往所观察到的实验结果至少应该是针对多种分子量角蛋白的综合作用，尚无法反映针对不同分子量角蛋白的单克隆AKaut

5、oAb的作用。目前AKautoAb的研究正面临两大问题：①临床应用：研制具有良好疗效、能批量生产且无毒副作用的产品，因此研发有效的抗角蛋白的基因工程抗体已是势在必行；②作用机理：在分子水平上阐明AKautoAb生物学作用的细胞与分子机理，特别是AKautoAb发挥作用的信号传导机制，后者是全面阐明AKautoAb生物学作用的基础。分子机理的研究是临床应用的基础，而临床应用又是阐明机理的目的。寻找更为有效和准确的研究方法及手段来尽快解决这些问题已迫在眉睫。我们进行取研究的目的就在于观察抗角蛋白基因工程抗体Fab片段的生物学效应、制备抗角蛋白基因

6、工程单链抗体及探讨抗不同分子量角蛋白的抗体生物学作用的、可能的信号传导机制，为今后的深入研究奠定基础。<主碉实验内容吸结果：＼／＼／第一部分人源性抗角蛋白单链抗体的克隆、表达及活性测定?1．利用基因重组技术对从半合成噬菌体抗体库中克隆的人源性抗角蛋白抗体Fab片段进行了改造，获得了人源性抗角蛋白SeFv片段。fDNA序列分析结果表明，pScFv的VK和VH基因序列同RRKZ的VK和Vn基因序列完全相同，表明在Fab片段改建成ScFv过程中未发生基因突变。用ELISA的方法测定可溶性表达的ScFv抗体与角蛋白以及铁蛋白、胃蛋白酶、HBsAg等无

7、关抗原的结合反应，发现ScFv能特异性地与角蛋白结合而与其它抗原不结合，说明人源性抗角蛋白Fab抗体改建为ScFv后具有较好的特异性和亲和力，但可溶性表达的ScFv的亲和力低于可溶性Fab片段；0、2．将利用噬菌体抗体库技术从半合成噬菌体抗体库中克隆到的人源性抗角蛋白抗体Fab片段成功地进行了可溶性表达。(表达产物经金属鏊合层析纯化后，并采用ELISA和Westernblot等方法进行鉴定。结果表明，可溶性表达的Fab片段不仅具有良好的抗原结合活性，而且，具有相当高的特异性，仅识别48KD的角蛋白，与其它分子量的角蛋白或铁蛋白、胃蛋白酶、HB

8、sAg等无关抗原无交叉反应；＼j第四军医大学博士学位论文i第二部分人源性抗角蛋白Fab抗体对培养KC增殖及凋亡的影响j1．采用MTT、3H．TdR参入实验观察了人源