体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响

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1、体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响[]目的利用牙胚细胞（TGC）作为诱导成牙环境，将牙髓干细胞（DPSC）、外胚间充质干细胞（EMSC）分别与其共培养，观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4d的大鼠TGC作为诱导成牙环境，将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养，免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白（DSP）的表达和碱性磷酸酶（ALP）活性的变化，免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果共培养7d后，EMSC共培养组DSP阳性细胞的转

2、化率高于DPSC共培养组（P<0.05）。免疫组化染色图像分析结果表明共培养7d后，共培养组与TGC单独培养组差异显著（P<0.05）。共培养组3、7d后ALP活性明显增高，EMSC共培养组较DPSC　　共培养组ALP活性高。结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后，能够诱导细胞向成牙本质细胞分化，EMSC分化能力高于DPSC。　　[关键词]牙胚细胞；牙髓干细胞；外胚间充质干细胞；细胞分化　　[]Q254[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1000-1182.

3、2012.06.005　　成体干细胞的增殖和分化离不开特定的微环境，微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。现有研究表明在不同的诱导条件下干细胞有向不同细胞分化的潜能，从而将其作为种子细胞参与组织的损伤与修复。牙髓干细胞（dentalpulpstemcell，DPSC）、外胚间充质干细胞（ectoblastmesenchyme　　stemcell，EMSC）都属于牙源性的间充质干细胞，它们在一定成牙诱导环境中的细胞表型及功能变化，对于组织工程化牙齿构建中种子细胞的筛选具有重

4、要的意义。本研究利用出生后4d的大鼠牙胚细胞（tooth　　germcell，TGC）作为诱导成牙环境，将DPSC、EMSC与其共培养，观察DPSC、EMSC对牙本质特异性蛋白牙本质涎蛋白（dentinsialoprotein，DSP）的表达及碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性的变化，观察DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力，为今后组织工程化牙齿的构建提供有益的探索。　　1材料和方法　　1.1实验材料　　K-SFM无血清培养液、表皮生长因子（epidermalgroa公司，美国），抗Brd

5、u单克　　隆抗体（武汉博士德公司），抗牙本质涎蛋白多克隆抗体（SantzCruz公司，美国），荧光二抗：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗鼠IgG、罗丹明（TRITC）标记的山羊抗兔IgG（DAKO公司，美国），激光扫描共聚焦显微细胞仪（奥林巴斯公司，日本），ALP试　　剂盒（南京建成生物工程研究所）。　　1.2方法　　1.2.1组织块酶解法培养TGC在体视显微镜下，分离出SD仔鼠（出生4d）下颌骨第一磨牙牙胚（组织块为1mm3），绞碎后放入37℃PBS缓冲液中，Ⅰ型胶原酶和Dispase消化，分离碎屑，离心后用无血清

6、K-SFM培养液洗涤1次，离心并用含0.15ng·mL-1EGF、25μg·mL-1BPE的K-SFM无血清培养液将其制成细胞悬液，转入培养瓶中，37℃、5%CO2孵箱中培养，每日换液。用细胞角蛋白多克隆抗体染色进行鉴定。　　1.2.2DPSC和EMSC的BrdU标记及鉴定将DPSC和EMSC分别接种于6孔板内，板内预先放置细胞爬片，当细胞铺满瓶底60%时，加入BrdU溶液分别孵育48h。取出玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛液固定30min，然后进行免疫组化染色鉴定。　　1.2.3TGC与DPSC、EMSC直接接触共培养根据

7、预实验结果，将标记好的DPSC、EMSC分别与牙胚细胞以1∶1的比例混合接种于6孔板内。　　1.2.4免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原DSP的表达取共培养1、3、7d的细胞进行免疫荧光双标检测，采用共聚焦显微镜进行观察。分别以546nm和490nm波长的激发光观察切片TRITC和FITC所标示的抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）；阴性对照采用一抗添加PBS。每张爬片随机选取8～10个不同的视野，分别计数每个视野内的细胞数及标记细胞的DSP阳性细胞数，计算各个视野阳性细胞数与细胞总数的比值，取其均值，即

8、为细胞的转化率。　　1.2.5共培养细胞的免疫组化染色鉴定对共培养的细胞同时使用LSAB组化试剂盒检测DSP表达。　　1.2.6图像分析[]目的利用牙胚细胞（TGC）作为诱导成牙环境，将牙髓干细胞（DPSC）、外胚间充质干细胞（EMSC）分别与其共培养，观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4