低氧微环境对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的研究

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1、重庆医科大学博士学位论文低氧微环境对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的研究姓名：黄姣申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：邓锋201205重庆医科大学博士研究生学位论文低氧微环境对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的研究摘要牙周炎是菌斑引起的牙周支持组织的慢性破坏性炎症，如何利用再生治疗方法获得牙周组织的再生，形成新附着，从而恢复天然牙齿的生理功能是国内外学者所追求的目标和着力研究的热点课题。骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，是牙周组织工程较为理想的种子细胞【1。31。种子细胞移植入牙周缺损处后因无血管化的同

2、步形成，刚开始时处于一个相对低氧的微环境，因此，研究移植入低氧微环境中的MSCs细胞的增殖、成骨向分化作用以及调控机理，对于该项技术的临床应用具有重要的指导意义。氧在细胞病理生理活动中起着至关重要的作用。细胞对环境氧反应的分子机制主要涉及低氧诱导因子-lot(hypoxia-induciblefactorlot，HIF．10t)信号通路[4'5】。HIF．10t是目前发现的惟一一个特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子。研究表明，低氧可以在绝大多数细胞中诱导HIF．10t的表达。低氧是人正常发育的一个重要的生理因素，并参与许多疾病的发生、发展。大多数研究认为，在正常组织里，氧分压一般

3、是4％----8％；且在不同的组织所检测到的氧分压是不相同的。例如，在骨髓内为2％一7％，在骨折处、伤口等组织里，氧分压更低，甚至不到l％[61。在骨发育过程中，组织和细胞缺氧是经常存在的。相关研究气重庆医科大学博士研究生学位论文证实，在软骨内成骨过程中软骨细胞生长的微环境逐步由缺氧环境转变成有氧环境p91。软骨内成骨过程中HIF．10t表达由强到弱，同时伴随着软骨细胞分化的关键基因Sox9的表达逐渐减弱，核心结合因子0【l(Corebindingfactor仅1，Cbfetl)的表达逐渐增强(Sox9和Cb缸1分别是软骨分化早期、晚期的重要转录调节因子)。Cb缸l是成骨细胞发生

4、和分化的特异性转录因子，能够诱导多潜能间充质细胞向成骨细胞表型分化，并激活骨钙蛋白(Osteocalcin，oc)、I型胶原蛋白(CollegenI，ColI)、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、骨涎蛋白(Bonesialoprotein，BSP)等成骨基因转录[10-12】。MSCs的成骨分化是一个相当复杂的过程，分化的每个阶段都是在许多生长因子、激素和蛋白激酶以及其抑制剂的共同控制之下进行。目前对MSCs成骨调控机制的研究主要集中于研究各种生长因子和激素，如转化生长因子一13(TGF-13)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子．1(IGF．1)、骨形成蛋

5、白(BMP)、甲状旁腺激素(PTH)等对MSCs细胞增殖、分化的单一调控作用，研究也取得了一定的进展。研究还发现MSCs细胞在体外培养时能自动向成骨细胞分化[13-17】。目前研究并未涉及何种基因表达的变化直接影响了MSCs细胞成骨分化关键基因Cbfod的表达变化，而这才是探讨MSCs细胞成骨调控机制的关键所在，尚待我们进一步的深入研究。本课题拟通过体外分离、纯化培养SD大鼠MSCs细胞，采用三气培养体系建立低氧一MSCs体外细胞培养模型，运用MTT、荧光标记技术、酶联免疫法、RNA干扰、实时荧光定量PCR及Westernblotting蛋白免4重庆医科大学博士研究生学位论文疫印

6、迹等技术方法，研究不同低氧分压、不同低氧作用时间对MSCs细胞增殖活性的影响、对体现成骨功能效应的碱性磷酸酶(ALP)的活性和I型胶原蛋白(ColI)的表达情况的影响、对成骨特异性转录调控因子一核心结合因子otl(Cbfetl)基因和蛋白表达的影响，以及缺氧诱导因子l仅(HIF—l仅)与Cbfotl表达的相互关系。从细胞和分子生物水平上深入探讨低氧微环境对MSCs细胞成骨向分化的调控，为应用MSCs细胞做为再生种子细胞修复牙周缺损提供理论依据。结果显示：1．低氧微环境可明显促进MSCs细胞的增殖活性，尤其在4％02分压下MSCs细胞的增殖最明显；2．低氧微环境抑制MSCs细胞AL

7、P、ColI的表达，提示低氧微环境抑制MSCs细胞的成骨向分化；3．低氧微环境明显促进MSCs细胞HIF．10t的表达，且呈时间依赖性，随着时间增加HIF．10t的表达增加；4．低氧微环境抑制MSCs细胞Cbfotl的表达，且呈时间依赖性，随着时间增加Cbfotl的表达减少；5．通过化学合成的针对HIF．1et的siRNA来抑制MSCs细胞HIF．10t的表达是有效的。转染的MSCs细胞48,J,时后在4％02的低氧环境中培养12d,时，Cbfal在mRNA和蛋白水平表达均有增加