亲环蛋白a对prrsv增殖的影响及其作用机制研究(可编辑)

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1、为了研究干扰Marc-145细胞巾内源性的CypA对PRRSV增殖的影响，我们设计合成了猴源CypA的干扰分子(由上海吉玛公司设计并合成)，序列分别为：si-CypA-F：5'-CCUGCUUUCACAGAAUUAUTT-3'si-CypA-R：5^AUAAUUCUGUGAAAGCAGGTT-3?si-NC-F：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’si-NC-R：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’并且设计合成了CypA的定量引物，实时荧光定量PCR引物见表4-1,Marc-145细胞接24孔细胞培养板，待细胞生长至7

2、0%-80%时转染CypA的siRNA,同时设立NC为对照组。转染换液后24h收取细胞样品，Trizol法提取细胞总RNA,并通过Real-timePCR实验检测CypAmRNA的表达变化情况，阁4-4(A)结果显示，合成的猴源si-CypA能有效抑制目的基因CypA的表达，干扰效果约为62%。与此同时，我们通过WesternBlot实验在蛋白水平对si-CypA的干扰效果进行了验证，与Real-timePCR结果相似，si-CypA能够显著抑制CypA蛋白的表达，如阁4-4(B)。说明合成的si-CypA能有效抑制目的基因猴源CypA的表达。4.2.3

3、空斑检测超表达及干扰CypA对PRRSV增殖的影响Marc-145细胞接种24孔细胞培养板，待细胞生长至70%-80%后分别转染猴源CypA真核表达质粒和干扰分子，并设立相应的空载体和NC作为对照，转染后24h感染PRRSV，病毒感染后24h收样，反复冻融3次，通过空斑实验检测PRRSV病毒的滴度，如图4-5。结果显示，超表达CypA促进PRRSV增殖，但是效果不明显;干扰内源性CypA能够显著抑制PRRSV的增殖。4.3空斑检测抑制剂CsA对PRRSV增殖的影响通过以上研究，我们证实了CypA在PRRSV的增殖过程中扮演着重要角色，接下来我们使用Cyp

4、A的抑制剂CsA,来进一步探讨其对PRRSV增殖的影响。4.3.1MTS方法检测CsA对Marc-145和PAM细胞的毒性实验后续实验主要是在具有PRRSV细胞嗜性的Marc-145和PAM细胞中进行，首先，为了排除抑制剂CsA对细胞的毒性影响，我们通过MTS方法检测了CsA对Marc-145和PAM细胞的毒性，Marc-145细胞毒性结果如图4-6(A),PAM细胞毒性结果如图4-6(B)。可知，在这两种细胞中，当抑制剂CsA的浓度均不大于8^mol/L时对Marc-145和PAM细胞几乎没有毒性(图4-6),故选择8(imol/L作为后续实验的最大使

5、用浓度。4.3.1空斑及WesternBlot检测Marc-145细胞中CsA对PRRSV增殖的影响将Marc-145细胞分别接种24孔及6孔细胞培养板，待细胞生长至50%-60°/。后换含不同浓度CsA的维持液(0.25(imol/L、0.5

6、imol/L、1(imol/L、2(imol/L、4

7、imol/L>8pmol/L),同时设立DMSO(8pimol/L)对照组，CsA作用12h后感染PRRSV(0.5MOI),37%：5%(：02吸附111,继续换含不同浓度CsA的维持液(句上)，PRRSV感染后24h分别收取空斑(24孔板)和Western

8、Blot(6孔)实验样品，空斑样品反复冻融3次，通过空斑实验检测PRRSV病毒的滴度，如图4-7(A)；通过WesternBlot实验检测细胞内PRRSVNsp2蛋白的表达，如图4-7(B)。我们发现在Marc-145细胞中，抑制剂CsA抑制PRRSV的增殖及PRRSVNsp2蛋A的表达，II呈现一定的剂量依赖性。将Marc-145细胞分别接种24孔和6孔细胞培养板(各4块)，待细胞生长至50%-60%后换含8jimol/LCsA的维持液，同时设立DMSO对照组，CsA作用12h后感染PRRSV,37丁5%(202吸附111,继续换含8jimol/LCs

9、A的维持液(向上)，分别于接毒后12h、24h、36h和48h收样，空斑样品反复冻融3次，通过空斑实验检测PRRSV病毒的滴度，如图4-7(C)；WesternBlot样品通过WesternBlot检测PRRSVNsp2蛋白的表达，如图4-7(D),说明PRRSV感染Marc-145细胞不同吋间，抑制剂CsA均抑制PRRSV的增殖及PRRSVNsp2蛋白的表达。4.3.3空斑检测PAM细胞中CsA对PRRSV增殖的影响将新鲜分离的PAM细胞接种24孔细胞培养板，37°C5%CO2静置数小时，待细胞贴壁后换含不同浓度抑制剂CsA的维持液(0.25pmol/

10、L、0.5gmol/L、1pnol/L、2

11、imol/L、4gmol/L、8pm