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1、研究组织工程微粒皮肤的构建及其性能-->摘要:目的探索利用人成纤维细胞和York猪脱细胞真皮基质(ADM)微粒复合构建组织工程微粒皮肤的可行性并对其进行初步研究。方法体外培养取自胎背的人成纤维细胞,用PKH26标记,将细胞与ADM微粒复合构建微粒皮肤,用荧光显微镜观察、电镜观察和MTT法检测组织工程微粒皮肤的性能。结果脱细胞真皮基质微粒均匀柔软,弹性、韧性好,三维结构完整且排列规则。细胞与ADM微粒的复合情况良好,2h后开始黏附,2d后增殖明显,10d增殖达到高峰;7d时取材,HE和SEM显示成纤
2、维细胞在ADM微粒表面成层黏附,并分泌大量基质;细胞生长良好。结论利用人成纤维细胞和York猪的ADM微粒可以构建具有活性的组织工程微粒皮肤。关键词:组织工程;微粒皮肤;脱细胞真皮基质;成纤维细胞Abstract:ObjectiveToexplorethefeasibilityofconstructionthetissueengineeringgranuleskinanfibroblastsandKeyicrogranularskin;acellulardermalmatrix(ADM);fibr
3、oblasts皮肤是覆盖与保护体表的重要组织器官。由于炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后及先天性畸形等原因常造成皮肤的缺损与异常。对于这种组织缺损目前多采用自体皮肤移植,这种方法不仅造成供皮区新的创伤缺陷,而且经常受供皮的限制。随着组织工程技术研究的深入,应用组织工程皮肤修复皮肤缺损是目前皮肤缺损修复研究的热点之一。脱细胞真皮基质(acellulardermalmatrix,ADM)是目前最有应用前景的支架材料,它去除了引发宿主排斥反应的细胞成分,完整地保留了细胞外基质的形态结构和组成成分,力学性能
4、好,抗原性低,可诱导具有再生能力的成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞按照应有的组织学方式长入真皮层,其临床应用效果最好,并且其在体内降解吸收与宿主组织改建相一致。笔者在实验中借鉴烧伤治疗中的微粒皮技术,利用改良消蚀法(另文发表)制备相容性良好的ADM微粒,与成纤维细胞复合构建组织工程微粒皮肤,以期延展组织工程在皮肤缺损修复上的应用前景。1材料与方法1.1材料York猪(第四军医大学实验动物中心提供);DMEM低糖培养基(美国Sigma公司);胰酶(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程
5、材料有限公司);超净工作台(Nuair公司);CO2孵箱(Nuair公司);倒置显微镜(Olympus公司);低温高速离心机(北京医用离心机厂);培养板(Falcon公司),;取皮鼓(无锡新达轻工机械有限公司);恒温箱(HHS21-4型,上海跃进医疗器械厂);扫描电子显微镜(TXA-840,日本电子光学公司);真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);全自动酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司MK3型酶标仪)。1.2新型-->脱细胞真皮基质微粒的制备取York猪(20kg)新鲜背部皮肤,切成5cm
6、×10cm大小,用取皮鼓反向取皮,去除含猪表皮面约0.3mm厚的皮片;将余下的猪真皮,再用取皮鼓同法于近表皮面取约0.3mm厚皮片,用质量浓度2.5g/L胰蛋白酶消化90min,大量纯水冲洗,然后将皮片用4%NaOH溶液消蚀,B型超声清洗仪间断振荡清洗,每隔4h更换消蚀液1次,消蚀18h时将皮片取出,用滴加青、链霉素的PBS浸洗24h以上,其间多次换液,直至溶液变为清亮,pH7.2。最后将皮片放于-80℃冰箱,反复冻融3次,每次4h,使细胞完全破裂崩解。然后置冷冻干燥机冻干,再用物理方法切割成约0
7、.3mm×0.3mm×0.3mm大小的ADM微粒,用PVC袋分装、60Co照射、无菌保存。取部分材料用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片后常规苏木精-伊红(HE)染色和扫描电镜观察,观察ADM微粒的颜色、结构和细胞残留情况。1.3成纤维细胞的分离培养及扩增背部皮肤取自合法水囊引产的5月龄男胎,将其切成2mm×5mm的条块,在4℃下用含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS浸泡冲洗,修剪多余的脂肪和肌肉组织,用质量浓度2.5g/L胰酶4℃消化,机械分离表皮层和真皮层,将真皮层吹散,收获
8、其中的成纤维细胞,接种于75cm2的培养瓶中,用含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液扩大培养并传代,取2～9代生长良好的成纤维细胞使用。1.4PKH26标记成纤维细胞细胞示踪剂PKH26是亲脂性的荧光染料,散发红色荧光。它可以与细胞膜不可逆地结合,对细胞进行荧光标记。按文献所述方法,在-->lue="25"UnitName="℃">25℃条件下进行,用质量浓度2.5g/L胰酶消化对数期生长的细胞,制备单细胞悬液,计数。用PBS洗涤上述单细胞悬液,离心5min,小心吸去上清,加入
