实验十五免疫标记技术

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1、医学免疫学实验指导实验十五免疫标记技术由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。BioRike简介：BioRike（中文简称"博瑞克"）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌，甶旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专

2、门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。—、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（EUSA）是将抗体（抗原）包被在固相表面后，按不同的步骤加入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗原），充分反应后用洗涤的方法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗去游离的酶标抗体（抗原），最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标、本中的抗原（抗体）进行定性或定量。ELISA的技术类型有多种，常用的有间接法、夹心法和竞争法等，本次实验介绍间接法，【实验目的】掌握酶联免疫吸

3、附试验的基本原理和临床意义，了解其实验操作技术。【实验原理】将抗原结合到固相载体上，当加入阳性标本后，相应抗体将结合到固相抗原上，利用酶标记的抗抗体可检测出标本中与固相抗原结合的抗体。【实验材料与仪器】抗原与抗体：伤寒0诊断菌液；待测血清；阳性对照血清；阴性对照血清；酶标抗人IgG抗体。试剂：包被稀释液；样本稀释液；辣根过氧化物酶底物液（TMB-过氧化氢尿素液）；终止液。仪器：酶标板；吸水纸；移液器等。【实验方法及内容】1.包被抗原：将抗原用包被稀释液做1:20稀释，每孔加入lOOpl，置37°C作用4h或4°C作用24ho2.洗涤：弃

4、去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次lmin。于吸水纸上拍干，4°C储存备用。3.加入待测样本：用样本稀释液对待测标本进行适当稀释，将稀释好的标本加入酶标板反应孔中，每孔lOOpl，置于37°C作用30min。注意应做阴性对照和阳性对照。并作复孔检测。弃去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次lmin。于吸水纸上充分拍干。4.加入酶结合物用样本稀释液对酶结合物进行适当稀释（根据酶结合物说明书提供的参考工作稀释度进行预试确定稀释倍数），将稀释好的酶结合物加入反应孔中，每孔100Ml,置于37°C作用30min。洗涤同第2步。5•加入底物显色每孔加辣根

5、过氧化物酶底物液lOOpl,置37°C蔽光显色10〜20min。6.终止反应当阳性对照出现明显颜色变化或阴性对照稍有颜色变化时，每孔加入终止液50pl终止反应，于20分钟内测定实验结果。【实验结果与判定】1肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。2.酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定OD值，本实验底物为TMB,最大吸收波长为450nm，因此应测定OD450值。【注意事项】1.加样本稀释液必须使用微量移液器；加入样本后必须混合均匀。2.严格控制反应时间，洗板时严格按操作规程进行，每一操作间隔不超过10min。【思考题】ELIS

6、A法用于检测抗原和检测抗体的类型各有哪些？各种方法有何特点？其临床应用如何？每免疫组化技术(Enzymeimmunohistochemistrytechnique)酶联免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在与否或定位的一类酶标技术。该方法。本实验以酶免疫组化技术检测CD3为例【实验原理】将组织或细胞制成切片或涂片，用酶标记的抗体检测组织细胞表面分子。本实验以CD3单克隆抗体与待检单个核细胞涂片作用，再用生物素化抗鼠IgG检测CD3单抗与待检细胞结合的情况，最后用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶放大系

7、统（ABC桥联法），CD3表面分子阳性细胞将被抗体与过氧化物酶结合物结合，在底物作用下将被染成棕黄色，CD3表面分子阴性的细胞不着色。根据细胞着色的情况可以判定CD3阴性和P日性的细胞，通过细胞计数测定其阳性百分率。【主要试剂与器材】1.正常山羊血清。2.抗CD3单克隆抗体。3.生物素化羊抗鼠IgG（二抗）。4.链霉亲和素-生物素-过氧化物酶（SABC）,5.3Z3z-二氨基联苯胶（DAB）。6.0.0lmol/LpH7.2PBSo6.淋巴细胞分离液。7.丙酮。8.玻片、吸水纸、显微镜等。【操作方法】1.采集外周血，以肝素抗凝。抗凝外周

8、血经淋巴细胞分离液梯度离心，分离单个核细胞。2.将单个核细胞制成涂片，室温风扇吹干。3.以纯丙酮室温固定20min（干燥后可冰冻保存）。4.滴加抗CD3单克隆抗体，37°C温育45min。5.将生物素化羊抗