冻存人源永生化肝细胞微囊用于生物人工肝治疗研究

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1、冻存人源永生化肝细胞微囊用于生物人工肝治疗研究一、肝细胞功能的体外评价引言据报道我国每年有约50万人死于肝脏疾病，其中急性肝衰竭的致死率高达60%-90%[r]。尽管传统对症支持疗法有了长足进步，其死亡率仍然居高不下。虽然国内肝衰竭病因与国外很不相同，即我国90%患者因病毒感染而欧美患者主要为药物或其它因素引起，国外报道的急性肝衰竭（FHF)病死率也在80%左右。因此，国内外学者一直致力于人工肝和肝移植治疗的研究。肝移植虽被认为是患者最有效的治疗手段，但存在以下问题[2]:1)供体不足问题突出，众多患者在等待供体期间死亡；2)肝移植手术生命危险性高；3)须终生使用免疫抑制药物；4)易发生各种

2、致命性感染；5)易继发肾功能衰竭及癌变；6)费用昂贵。人工肝借助体外物理型、化学型等体外支持系统，可以暂时、部分替代肝脏功能，从而辅助治疗肝功能不全、肝衰竭以及相关的肝脏疾病。人工肝主要为改善机体内环境，促进肝细胞再生，为患者接受内科治疗争取机会或者使肝衰竭患者自然恢复从而避免肝移植，降低手术风险，减少并发症等[3]。尽管经过几十年的研究开发，非生物人工肝也获得了很好的成果[4-6]，但是各种非生物型人工肝原理不同但均偏重于解毒，不具备肝脏的代谢、合成等功能，难以对肝衰竭患者提供全面的支持治疗，限制了其疗效的进一步提高。近年来国际及我国人工肝的研究方向已经从传统的非生物转为以肝细胞为基础的生

3、物人工肝（BAL)研究。BAL是生命科学、材料学和工程学共同发展并相互融合的产物，其基本思路是在体外分离、培养细胞，用一定数量的细胞接种到具有一定空间结构的支架材料上，通过细胞间的相互黎附、生长繁殖、分泌细胞外基质，形成具有一定肝脏结构和功能的肝组织，从而起到肝功能支持作用。因此，BAL的发展有赖于各学科领域的知识综合分析共同研究。.材料和方法各种细胞用含10%FBS的DMEM高糖培养基(添加50mg/L青霉素和50mg/L链霉素)，置于二氧化碳培养箱(371、5%C02、100%湿度)中培养。倒置相差显微镜观察细胞形态。待细胞达到70~80%以上密度时，用胰酶消化液消化细胞，300g离心5

4、min,沉淀下的细胞以1:3的密度传代。在96孔板的每孔接种细胞IxlO4个，在各孔的100[11培养基中加入10的MTT,37°C、5%C02培养箱中孵育4h,加入试劍盒提供溶解液后37°C孵育过夜。用酶联检测仪检测595rnn波长下的吸光度（0D)值。实验重复三次，每次3个复孔。将样品白蛋白浓度稀释到标准品浓度范围之内，加100ul标准品或样品于相应的孔内。室温孵育60min后，移去每孔内液体，用洗涤液反复洗涤5次。加辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)抗体：用样品稀释液稀释按1:5000稀释HRP抗体，每孔加100稀释后HRP抗体，室温孵

5、育60min后，移去每孔内液体，用洗涤液反复洗漆5次。..二、微囊化肝细胞的制作及大规模冻存研究引言体内肝细胞生长微环境为三维立体结构，例如上文提到的肝板结构和肝窦结构。虽然体外二维培养原代肝细胞可以在短时间维持存活，但其特异性功能迅速消失[16]。Ben-Zeev等[17]证明其原因为肝细胞的物理变形改变了其命运。为了解释此现象，Ingber等提出了Tensegrity模型[18]。此模型是指细胞在连续张力和不连续张力平衡基础上形成的结构稳定性。Tensegrity模型中，细胞可以通过微管的扭曲调节内部的压力及张力。然而，以此模型为基础二维三维培养体系中细胞组成成分及结构变化的研究还为数很

6、少；一些细胞实验也只是定性的描述了在两种培养条件下，NuMA、laminB、SRnil60和Rb在细胞核中的分布不同。例如：KnoA的分布有十分明显的改变，引起NuMA重组，进而影响染色质的结构[19]。此外，当外力信号传输到肝细胞染色质时，其基因表达的乾向性存在两种假说：一种假说为染色体上基因组的机械敏感区域与细胞核骨架相连接，外力信号造成染色体解聚；另一种假说为基因乾向性取决于染色体区域的稳定性，外力信号可引起高乙酰化区域解旋[20]37。细胞形态怎样影响哪些基因表达改变还有待进一步研究。肝细胞的冻存和运输是BAL和HCT临床应用的重要条件之一。游离肝细胞冻存和微囊化肝细胞相比，步骤繁琐

7、而且冻存过程中易形成冰晶导致肝细胞损伤。微囊化在保护因冻存造成的损伤中发挥了一定的作用。Mahler等[23]比较了不同条件下微囊对小鼠肝细胞的保护作用，发现微囊包裹肝细胞活力冻存后下降9%而悬浮肝细胞下降19%;另有多项研究显示，微囊化肝细胞和游离肝细胞相比，活性和功能保持更好。由此表明微囊化可更有效保护肝细胞，减轻因低温诱导的肝细胞调亡，进而促进肝细胞活性和功能[24]。本实验将海藻酸纳应用于微囊化Hep