新型生物人工肝用肝细胞保存液实验的研究

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1、硕士学位论文1洲㈣判必Y1997938新型生物人工肝用n-T坌m胞保存液的实验研究硕士研究生：秦佳升指导教师：高毅摘要研究背景：我国的肝移植数每年在700例以上，1年生存率超过50％，最长存活时间超过6年。但是我国重型肝炎患者多供器官缺乏，许多患者得不到及时的肝移植手术而丧失存活机会，同时有效的供体资源也未能充分利用。因此生物人工肝与肝细胞移植等细胞水平的新治疗方法得到了研究与发展。肝细胞移植和生物人工肝支持在大量动物实验和一些临床实验中获得良好效果，成为有前途的肝病治疗途径。实际上，如果肝细胞移植及生物人工肝在临床的大量运用，肝

2、细胞的需求量必将增加，同器官移植一样面对的供者不足的情况也将要出现。若有一实用可靠的低温储存技术，建立一个肝细胞库，危重患者随时都能得到大量高活率、有功能的肝细胞：肝细胞移植和生物人工肝技术就能普遍推广。20世纪70年代以来多种器官及组织保存方法的研究从基础理论、动物实验到临床应用都取得了重大的进展，对于器官保存中细胞和组织损伤的基本机制有了更为深入地了解，使得器官的有效保存时间明显延长，诸如UW保存液、HTK液、Celsior液等保存液的开发与应用，极大地促进了临床移植工作的开展。我国最近10多年来器官移植工作得到了飞速发展，在

3、器官保存过程中的损伤机制以及器官保存液方面的研究也有一定的突破。但是，由于依赖进口保存液、成本高昂、不易获得，在一定程度上制约了我国器官移植的发展。这就迫切需要研制一种具有自主知识产权的低成本的新型生物人工肝用肝细胞保存液来适应生物人工肝中文摘要的发展。新型生物人工肝用肝细胞保存液配方设计的特点在全面分析UW液和HTK液等多种配方的基础上，吸取国内外器官保存液的优点，遵循保存液配制的原则，Belzer等根据低温下器官的各种病理生理特点，提出了一种有效的器官低温保护液的成分，必须具备以下六个方面的特点：①减少因低温导致的细胞水肿②防

4、止细胞的酸化作用③防止灌洗过程中的细胞间隙的肿胀④防止氧自由基的损伤，尤其在再灌注过程中⑤提供再生高能磷酸化合物的底物⑥保持细胞内环境稳定。结合器官保存领域的新进展，简化改良上述两种先进保存液的成分，降低其成本，经过反复配制及验证而成。新型生物人工肝用肝细胞保存液以所含组分来源丰富，成本低，不同于既往细胞保存液，各组分有确定的成分及浓度，其主要由双糖、多聚糖、多肽、金属离子、磷酸根离子等组成，因不需要添加血清等其他异种抗原及有细胞毒性的二甲基亚砜，避免了被未知病毒污染的危险及引入异种抗原后的抗原抗体排斥反应。因而细胞在低温保存后不

5、用经特殊处理即可以用于生物人工肝生物反应器，很好满足了临床生物人工肝要求肝细胞材料的供应快速、应急(ready—to．use)的要求。该生物人工肝用肝细胞保存液含有的基本组分是能够维持低温状态下肝细胞的活力和电解质生理浓度，其所含的组分主要是能够减轻细胞内酸化，减轻氧自由基损伤、稳定细胞膜结构、提高细胞能量、减少低温导致的细胞水肿。在配方设计上，吸收了UW液、HTK液等保存液的优点同时具备了自己明显的特点：1．具有强大的缓冲能力。选取两种缓冲对，HP04／H2P04及柠檬酸盐(枸橼酸盐)两种缓冲对，防止细胞在低温状态的酸化作用。2

6、．选用非渗透性保护剂海藻糖(trehalose)，起到稳定细胞膜和蛋白质结构的作用，减轻低温状态下细胞水肿。3．添加了外源性三磷酸腺苷、氯化镁作为再生高能磷酸化合物的底物，通过ATP—M92+为细胞提供能量。n硕士学位论文4．采用还原型谷胱甘肽及有万能抗氧化剂之称的a一硫辛酸作为抗氧化系统及抗凋亡系统，防止或减轻细胞再灌注损伤，自由基对细胞的损伤。5．引入中药的活性成分苦参碱，利用其抗氧化性，增强保护作用。6．用羟乙基淀粉，提高胶体渗透压的方法，减轻细胞水肿。研究目的：针对现有保存液的缺陷，研制具有自主知识产权的低成本的新型生物人

7、工肝用肝细胞保存液，并通过与UW液的比较，初步探讨其对于生物人工肝用肝细胞C3A细胞的保存效果，以及探索肝细胞保存的原理，延长肝细胞低温保存的时限，为下一步过渡到临床应用提供一定的理论和实验依据。研究方法：’1．采用规范的制剂标准，按照配方配制新型生物人工肝用肝细胞保存液，pH值调定为PH为7．2．7．4，渗透浓度渗透压为305+10mmol／L。2．实验分组I组：即对照组，常规培养C3A细胞不经低温保存；按保护液不同分3组，II组：乳酸钠林格氏液(RL)；Ⅲ组：新型生物人工肝保存液(NBS)；Ⅳ组：UW液。3．肝细胞的低温保存及

8、复苏：将培养传代后C3A细胞经0．25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以3x105个细胞接种于6孔培养板中常规培养48h，允许细胞贴壁生长。将细胞培养液弃去，用预先冷却至4℃的PBS漂洗细胞2次，分别加入2mL预先冷却至4℃的各组保护液，封口膜封口保