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1、DEK蛋白在星形细胞肿瘤和正常脑组织中的表达水平 星形细胞肿瘤为神经外科领域的难治性疾病之一,寻找其新的治疗手段成为当前研究的热点,随着分子生物学、分子遗传学、分子免疫学及转基因技术等学科的发展,发现了许多与该肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因,尝试应用基因治疗方法来治疗星形细胞肿瘤,具有很好的应用前景。 DEK原癌基因最初在(6;9)(p23;q34)染色体异位的一类急性髓性白血病(acutemyelocyticleukemia,AML)亚型中发现,其高表达与肿瘤密切相关,在宫颈癌、鼻咽癌等恶性肿瘤中高表达,与肿瘤的发生、发展变化
2、,以及一些肿瘤的耐药性相关。 本研究应用E、0.5%TritonX-10、10mmol/LPMSF)中匀浆,15000转/分4℃离心5min,取上清于-70℃保存。按照蛋白定量试剂盒(DCProteinassay)的说明进行下述操作:首先将20μl试剂加入1mlA液中变成A',然后将蛋白标准品分别稀释成1.42、0.85、0.63、0.47、0.28μg/μl;取5μl标准品和样品加入干净干燥EP管,加入25μlA'和200μlB液,室温混合5min,15min后应用紫外可见光分光光
3、度计于750nm测定蛋白吸光度值,并根据标准曲线得出蛋白实际含量。 1.2.2SDS-PAGE电泳将玻璃板用清洗剂洗净,晾干。配制12%分离胶,将分离胶注入玻璃板夹层中,上面流出灌注积层胶所需空间(梳子的齿长再加上1cm)。用吸管在胶面上覆盖一层超纯水,保持胶面平整,将凝胶垂直放置在室温下。待分离胶完全聚合后(30min),倾出覆盖层的液体,用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。配置好4%浓度的浓缩胶,将其直接灌注在已聚合的分离胶面上,立即在浓缩胶中插入干净的梳子,小心避免混入气泡,再加入浓缩胶液以充满梳子间的空隙,将凝胶
4、垂直放置在室温下。待浓缩胶完全聚合时,将待分析的蛋白质样品置于1SDS凝胶加样缓冲液中,100℃加热3-5min使蛋白质变性,插入冰浴冷却后上样。在电泳槽中加入电泳缓冲液,拔出上样梳,然后用注射器洗干净加样孔,用微量加样器分别吸取待分析样品,根据蛋白质的浓度和加样孔体积决定加样量。 加样完毕后,接通电源,起始时用低电压或低电流,当样品在浓缩胶部分浓缩成一条直线,进入分离胶后,将电源电压或电流提高,继续电泳直至溴酚蓝指示剂到达分离胶底部边缘时即可停止电泳。从电泳装置上卸下玻璃板,放在纸巾上,撬开两层玻璃,取出凝胶。 1.2.3转膜将电
5、泳后的胶取出浸入转移缓冲液中,水平摇床缓慢摇30min,裁取相同大小的硝酸纤维素膜(PVDF),甲醇浸透,弃去甲醇后浸入蒸馏水或1TBS中,再将PVDF膜浸入转移缓冲液中至少5min。用转移缓冲液浸湿一张厚滤纸,铺于半干转印仪的底层电极板上,将PVDF膜铺于滤纸上,勿留气泡,将凝胶贴于PVDF膜上,不留气泡,润湿另一张滤纸,盖在凝胶上,用玻璃棒赶去气泡。盖上顶层电极板,接通正负极电源,15V(不超过25V)转印10-30min。 1.2.4杂交取出PVDF膜,1TBS洗一次,和胶相邻面向上浸入封闭液中置于水平摇床缓慢摇1小时至过夜。倒
6、掉封闭液,用洗膜液略洗一下,加入用杂交液按1∶1000稀释的DEK一抗,在摇床上室温杂交30-90min。取出PVDF膜,用洗膜液洗3次,每次5-15min。倒掉洗膜液,加入用杂交液按比例(1∶2000)稀释的辣根过氧化酶标记的二抗,摇床上杂交30-60min。取出膜,用洗膜液洗3次,每次5-15min。 1.2.5化学发光反应(ECL)倒掉洗膜液,将PVDF膜夹于吸水纸中,吸去多余的液体,转膜时和胶相邻的一面向上,铺于玻璃板上。将ECL试剂盒内detectionreagent1与detectionreagent2等体积混合后,均匀
7、滴在PVDF膜上,反应1min。夹起PVDF膜,用吸水纸吸去多余液体。用保鲜膜包好PVDF膜,固定于片夹内,准备曝光。 1.2.6洗片裁好底片,大小与膜相当,压片。显影3min,水中漂洗几次,定影10-15min,清水冲洗,根据显影时间,确定下一张曝光时间。在膜上标记出Marker的分子量。自动电泳凝胶成像分析系统(ChemiImager5500)下自动成像,F1uorChemV2.0系统分析目的蛋白条带的IDV,将DEKIDV与β-actin蛋白条带的IDV比值作为DEK蛋白的相对含量。重复实验3次,取平均值行统计学分析。
8、 1.3统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。所有数据以均数±标准差(珋x±s)表示,组间比较用One-n;0.11,在高级别星形细胞肿瘤组织中为0.85&
