trail在正常椎间盘细胞中的分布及表达

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1、TRAIL在正常椎间盘细胞中的分布及表达【关键词】细胞凋亡椎间盘肿瘤坏死因子［ABSTRACT］ObjectiveTodeterminethedistributionpatternoftumornecrosisfactorsuperfamilymemberTRAILinnormalintervertebraldisc.MethodsSamplesofnormalintervertebraldisctissuesincludingnucleus,annulusandendplate(n=31)munohistoc

2、hemicalstainingicroscopically.ResultsExpressionofTRAILalintervertebraldisctissueexhibitsaspecialdistributionpattern,suggestingthattheapoptosisinnormaldiscsmayfolloediatedpathornecrosisfactors腰椎间盘退行性变发病原因有多种，如年龄、遗传、机械外力、吸烟等，其确切的生物学和病理生理学发病机制仍然不清楚［1～5］。正常椎间盘的退

3、变最早发生于十几岁的青少年［4，6，7］。大量的研究显示，椎间盘退变与椎间盘细胞凋亡有关。退变椎间盘中椎间盘细胞凋亡机制仍然未阐明。在与细胞凋亡有关的众多因素中，肿瘤坏死因子超家族成员发挥了重要的作用［7］。到目前为止，已发现了3种诱发细胞凋亡的死亡因子FasL、TNFα及TRAIL,它们通过死亡诱导信号途径来促使细胞凋亡。尽管一些人研究了人体椎间盘退变中FasL、Fas受体、TNFα及其受体的表达，但肿瘤坏死因子超家族其他成员如DR4、DR5等受体及其配体TRAIL能否在正常椎间盘细胞中表达，以及它们的结

4、合是否能诱导椎间盘组织细胞凋亡尚没有得到证实。1材料与方法1.1材料及其从20例非正常死亡的身体健康且没有椎间盘突出家族史者（年龄18～25岁）体内获得31个腰椎间盘，均包括髓核、纤维环及软骨终板。常规取材，用40g/L中性甲醛溶液固定标本，石蜡切片，片厚3μm。1.2TRAIL检测采用免疫组化DAB染色方法。石蜡切片脱蜡至水，用蒸馏水新鲜配制体积分数0.02H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。在温度为93～98℃、pH6的柠檬酸缓释液中进行抗原修复20min，体积分数0.05正常山羊血清

5、（PBS稀释）室温放置20min封闭非特异性抗原，滴加适当比例（1∶50）稀释的一抗TRAIL(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,Calif,USA)，4℃过夜。滴加1～3滴第二代生物素标记二抗工作液，室温孵育20min。滴加第二代辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20min。DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。1.3结果观察及数据处理对每个椎间盘的3个不同部分（髓核、纤维环、软骨终板）分别进行观察分析。DAB显色结果显示：TRAIL抗体染色的阳性细胞胞浆呈黄

6、褐色，细胞核呈蓝色，而阴性细胞核呈蓝色，胞浆不显色。从每张切片的3个不同部位中（髓核、纤维环、软骨终板）取5～10个高倍镜视野（400倍），计数阳性细胞数及细胞总数，计算阳性细胞所占的百分比。使用SAS软件进行数据处理及统计学分析。2结果椎间盘标本的髓核、纤维环及软骨终板中均有TRAIL表达，其阳性率分别为（18.23±4.85）%、（9.51±4.19）%、（12.43±6.07）%。髓核组织中TRAIL表达高于纤维环及软骨终板，纤维环中表达最低，差异有显著性(F=23.51,q＝3.190～9.526，P&

7、lt;0.05）。3讨论细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它们包括Fas（Apo1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAILR1和DR5/TRAILR2。其配体属于TNF家族。正常椎间盘的细胞凋亡是维持椎间盘细胞数量动态平衡的基本措施。新生儿的椎间盘髓核中的软骨细胞死亡数较胎儿时期增加；3～10岁儿童髓核中细胞死亡明显增加［6，7］。本实验中椎间盘组织取自健康无椎间盘突出病史的18～25岁的青年，免疫组化染色可以发现TRAIL阳性细胞，虽然其表达率较低，

8、但在髓核中的表达均高于纤维环，说明此年龄段正常椎间盘也存在细胞凋亡，椎间盘细胞出现退变。在分子及细胞水平上椎间盘细胞内基质退变的一系列变化导致了椎间盘复合体的生物力学方面的失调［8］。在10～15岁时椎间盘的血供减少可引起椎间盘组织成分的退变，11～16岁时可以看到椎间盘的各种退变，细胞死亡明显增加与软骨细胞的广泛增殖有关；17～20岁时，椎间盘中细胞死亡的数量明显减少，而颗粒状改变、