从大容量抗体库中筛选抗tnfα人单链抗体

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1、从大容量抗体库中筛选抗TNFα人单链抗体：王欲晓,乔媛媛,周丽君,王琰【摘要】目的:从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗TNFα的人单链抗体（scFv）。方法:以TNFα为抗原,通过“吸附洗脱扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果:经过4轮筛选,获得62个与TNFα结合的阳性克隆,其中27个特异性结合的克隆,指纹分析有7种不同的可变区片段;其中5种获得可溶性表达;基因序列分析表明其轻重链分属VλⅠ和VHⅣ亚群。结论:利用单链大容量抗体库技术可以不经免疫制备获得特异性抗TNFα的scFv,为今后的研

2、究和应用提供依据。【关键词】大容量噬菌体抗体库;TNFα;噬菌体抗体肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα,TNFα）是炎症反应的主要介质,研究发现TNFα水平的升高与多种病理过程有关。如类风湿性关节炎(RA)、感染及创伤引起的休克、炎症性肠病(Crohn’s)及移植物抗宿主病等。抗TNFα单克隆抗体(mAb)对这些病理过程可以起拮抗作用,从而可能对许多疾病有治疗作用［1］。目前国外已将抗TNFα抗体作为治疗RA、Crohn’s等的药物正式进入临床并显示出良好的应用前景。由于鼠源mAb具有异源性,限制了其在人体内的应用,人抗体的制备难

3、度很大。抗体库技术的出现为人抗体的制备提供了有效手段。我们实验室构建了大容量噬菌体抗体库,并从中筛选出多种针对不同抗原的特异性抗体［2］。本实验拟从大容量噬菌体抗体库中筛选出抗TNFα的人单链抗体(scFv),为今后的研究和应用提供依据。1材料和方法1．1材料大肠杆菌菌株XL1Blue、Bs1365、无琥珀抑制子的大肠杆菌菌株HB2151和VCSM13为本室保存;大容量噬菌体抗体库为本室构建,详细过程见文献［2］;重组人TNFα抗原由我实验室表达和纯化;限制性内切酶为TaKaRa公司产品;卵清蛋白（OA）和铁蛋白（Fer）购自Sigma公司、各种酶标抗体购自

4、Promega公司和Sigma公司;抗原管（Immunotube）购自丹麦NUNC公司。1.2方法1.2.1大容量噬菌体抗体库工作库的制备原始噬菌体抗体库以100∶1的比例（multiplicityofinfection,MOI=100）超感染BS1365细胞,37℃水浴保温1h,使多副本载体进入同一个细胞［2,3］,加2YT至400mL,补足Amp100mg/L振荡培养至OD=0.5左右加5mL辅助病毒VCSM13(pfu=1.7×1012),30℃培养过夜,次日收集噬菌体抗体库,测定滴度。再以MOI≤1的比例感染1000mL对数生长期的XL1Blue菌,3

5、7℃静止30min,取少许铺含Amp的培养盘计算库容,补足Amp,加入10mLVCSM13,30℃过夜,次日回收上清,常规PEG沉淀,获得工作库。1.2.2抗TNFα抗体的筛选将TNFα用0.05mol/L碳酸盐Buffer稀释至100mg/L,以1mL包被免疫管,4℃过夜,次日用30g/L脱脂奶粉封闭2h,加入1mL噬菌体抗体库（约1×1013个CFU）,37℃孵育2h,以含0.5mL/LTL新鲜XL1Blue菌直接感染,37℃孵育15min,转入10mLSB培养液中;再将细菌感染回收后的免疫管中加入1mL洗脱液（0.1mLHCl,以甘氨酸调至pH至2.2

6、）37℃静置15min再进行洗脱回收。用吸管将洗脱液吸出后,加入45μL2mol/LTris中和,再加入2mLXL1Blue细胞37℃静置15min,加入7mL的SB培养液。从2次回收的菌液分别取出适量铺氨苄青霉素培养盘测定滴度（CFU）,其余菌液37℃培养3h,扩大体积到100mL,加入1.7×1012pfu辅助病毒VCSM13,30℃振荡培养过夜。每轮筛选后均测定次级库的滴度,并计算噬菌体抗体的投入产出比（回收率）,作为特异性噬菌体抗体富集的指标。次日回收上清,常规PEG沉淀,所得次级噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选［4,5］。1.2.3噬菌体抗体的筛选从筛选

7、第三、第四的培养盘随机挑取集落在含有Amp的2YT培养液中过夜,第2天取30μL细菌到1mLSB培养液中,37℃培养至对数生长期,加入辅助病毒VCSM13,30℃培养过夜,收取上清即得到噬菌体抗体。1.2.4ELISA试验鉴定噬菌体抗体将抗原稀释至10mg/L,以50μL包被ELISA板,1h后弃去孔内液体,用30g/L脱脂奶PBS封闭后加入噬菌体抗体液,37℃孵育1h,用0.5g/LTAb进行反应,洗涤后加入OPD底物显色,读取A490值。1.2.5可变区基因的多样性分析（DNA指纹）从筛选到的阳性克隆提取质粒,以此为模板,PCR扩增scFv基因,PCR产物用

8、CL6B