大鼠胰腺发育中肝细胞因子受体编码基因的

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1、大鼠胰腺发育中肝细胞因子受体编码基因的【关键词】cmet；胰腺生长发育；RTPCR；免疫组化【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionandlocationofcmetprotooncogeneinthedifferentdevelopmentstagesofratpancreas.MethodsUsingRTPCRtodetecttheexpressionofcmetprotooncogeneindifferentdevelopmentstagesofratpancreas:embryonicday15.5，embryonic

2、day18.5，postnatalday14，postnatalday21，nemunohistochetodetectthelocationoftheproteinofcmetprotooncogeneinthedifferentstagesofratpancreaticdevelopment.Resultscmetprotooncogeneexpresseshighlyatratpostnataldays,espaciallyatP14、P21ofratpancreaticdevelopmentstages.Conclusioncmetprotooncogenemaypla

3、yaroleinthedevelopmentofratpancreasespaciallyintheisletremodationofpostnatalratpancreaticdevelopment.【Keyetprotooncogene，pancreaticdevelopment，RTPCR近年来，原癌基因cmet受到越来越广泛重视。其编码蛋白的不同亚型异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关［1～3］。自Lobstein和Recamier提出肿瘤的胚胎性源性概念以来,胚胎细胞与恶性肿瘤细胞生物学的比较研究日益受到了人们关注［4］，肿瘤细胞的发生、发展和胚胎发育过程存在一定的相似性

4、［5～7］。在人类该基因全长为6641bp,存在不同转录本，大鼠该基因全长4189bp,编码形成的cMET蛋白与人类的cMET蛋白具有高度的同源性。2004年Atsushi等用流式细胞仪在成年小鼠胰腺导管上皮细胞检测到cMET蛋白的表达［8］。而该蛋白在胰腺发育不同阶段的表达及定位，未见明确报道。本研究以SD大鼠为模型，选取孕15.5d（E15.5）、孕18.5d（E18.5）及新生、生后14d(P14)、生后21d(P21)及成年这几个大鼠胰腺发育和功能完善的关键时期，通过RTPCR技术对cmet原癌基因在胰腺发育不同阶段的表达做出初步分析，并用免疫组化技术对该基因所编码的蛋白

5、在大鼠胰腺不同发育阶段的表达进行定位分析，为揭示cmet基因在胰腺发育细胞功能完善过程中的作用提供了一定依据，为临床糖尿病的治疗新途径提供一定的理论数据。1材料与方法1.1材料成年SD大鼠60只，雌20只，雄40只，体质量250g左右，由滨州医学院动物中心提供。mastercyclerPCR仪（Eppendorf公司）,TrizolReagent(美国Gibco公司),RNAeasyMiniKit(Qiagen),RTPCR试剂盒(Tayobo)，羊抗鼠单克隆抗体（美国Santacruz公司），兔抗羊二抗（福建迈新公司）。1.2方法1.2.1组织取材：于6：00PM时，将雌雄大鼠以1∶

6、2合笼，次日检测有阴栓者，定为受精0.5d(E0.5)，取E12.5，E15.5和E18.5胚胎胰腺以及新生鼠胰腺；取怀有胚胎E15.5和E18.5的母鼠，引颈椎脱臼处死，分离出胚胎，显微解剖镜下用显微镊子取出胰腺后，迅速在液氮中冷冻。新生、P14、P21和成年鼠直接分离出胰腺［9］。1.2.2RTPCR扩增：根据基因文库cmet的序列，用Primer5.0设计PCR扩增引物。上游引物:5′CCACCCCAATGTTCTCTAC3′,下游引物:5′GGTGGTGAACTTTTGCGTCT3′，预计扩增产物514bp；引物由江苏赛百盛基因有限公司合成。取1μg的E15.5、E18

7、.5、新生、P14、P21和成年六个时期（每组5只）胰腺组织总RNA进行反转录：反应条件为30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃5min，合成cDNA。cmet的PCR条件：引物：94℃5min；94℃30s，59.5℃30s，74℃1min，33个循环。RTPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外光下进行观察照相。用捷达801系列凝胶分析软件进行凝胶密度扫描分析，计算待测基因PCR产物各