斑点杂交法检测sen病毒感染

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1、斑点杂交法检测SEN病毒感染【关键词】聚合酶链反应　　【Abstract】AIM:ToexploretheavailabilityofdotblotassayinthedetectionofSENvirusinfection.METHODS:Nuclearacidserumspecimens,anddotblotanalysisandpolymerasechainreaction(PCR)ong191samples,6ples.　　【Keyerasechainreaction　　【摘要】目的：探讨斑点杂交法检测SEN病毒（SENV）感染的应用价值.方法：应用地

2、高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENVDNA，与聚合酶链反应(PCR)检测结果相比较.结果：在191份血清中，采用斑点杂交法检出6份阳性，检出率为3.1%.PCR方法检测出11份阳性，阳性率5.8%.结论：制备的地高辛探针具有SENV特异性，以地高辛标记的SENV探针可用于检测SENV感染.　　【关键词】SEN病毒；斑点杂交；聚合酶链反应　　0引言　　目前，国外对SENV基因组研究表明，SENV可分为SENVA至SENVH8个亚型，各亚型间基因序列差异在15%~50%之间，各亚型与TTV原型株间基因序列差异为40%~60%［1］.尽管国

3、内外学者对SENV感染进行了不少报道，但是仍然没有给出SENV的感染复制场所的直接证据［2，3］.我们进行了地高辛标记SENV探针的研究并评价其对SENVDNA直接检测的应用价值.　　1材料和方法　　1.1材料系1997/1998收集的191例不同人群血清标本，包括慢性乙型肝炎患者、重症肝炎患者、非甲~非戊肝炎患者、血浆置换患者、静脉吸毒者和正常人群.所有血清样本采集后于-70℃冰箱保存.　　1.2方法　　1.2.1SEN病毒核酸探针的制备选择SENV开放阅读框2(ORF2)4区域设计、由上海博亚生物技术服务有限公司合成引物.外引物为:Senseprimer:

4、5′GAGTTTACACACCGCAG3′Antisenseprimer:5′GTCTTATGTACCGTCTCC3′；内引物为：Senseprimer:5′GGTGGCACGGGATCCAAAAATGCACTTTTC3′Antisenseprimer:5′GGTGGCACGGATCCTAAAAATGCACTTTTC3′.通过套式PCR反应从患者血清中扩增得到长511bp片段，连接pRSETB载体，转化大肠杆菌.在挑取阳性克隆提取重组质粒进行测序鉴定后扩增重组质粒，以BamHⅠ单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，取1μg以博士德公司地高辛DNA标记和检测试剂盒

5、进行标记，操作按试剂盒说明书进行.　　1.2.2血清样品DNA的提取病毒核酸抽提试剂为美国Biotronics公司AcupureDNA/RNA提取试剂盒,取50μL血清加100μL裂解液充分混匀，80℃温浴10min,取出室温平衡5min，加150μL异丙醇混匀，经15000g10min离心沉淀，去除上清液，加50μL700mL/L乙醇试剂洗涤沉淀,再离心去除上清液，室温风干，加50μL样品稀释液重悬样品，80℃温浴5min,离心后将上清液备用.　　1.2.3PCR检测取各份提取核酸5μL作为模板加入第1次PCR反应体系.50μL反应体系中镁离子终浓度为15m

6、mol/L,dNTP终浓度各为200μmol/L,TaqP为2u，外引物各为50pmol，以94℃变性3min，55℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环；取第1次PCR产物2μL加入第2次PCR反应体系，50μL反应体系中内引物各为50pmol，余同第1次PCR,循环参数同第1次PCR，共进行30个循环.PCR结束后收产物加于80g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，预期PCR产物应为511bp.　　1.2.4斑点杂交取各份提取核酸20μL及定量系列稀释重组质粒，煮沸10min后立即置于冰浴，加入等体积20×SSC，点样于硝酸纤维素膜上，以真空泵抽吸，80℃烤膜

7、2h，参照试剂说明书进行杂交及链酶亲合素生物素过氧化物酶复合物(SABCPOD),显色.探针浓度为25μg/L.　　2结果　　2.1斑点杂交检测结果检测标本共191份，其中6份为阳性，阳性率为3.1%.在同一张硝酸纤维素膜上，同时点上定量倍比稀释的SENV重组质粒（分别为625.0,125.0,25.0,5.0,1.0,0.2和0.04pg），在质粒1.0pg（换算成SENVDNA拷贝数相当于2.7×105）时可看到较明显的阳性斑点(Fig1).　　3讨论　　SENV是一组无包膜、单链、环状的小DNA病毒，其基因组长度约为3900个核苷酸.从生物物理特征、基因

8、组序列及其编码蛋白分析结果来看，SEN