斑点杂交法检测sen病毒感染论文

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1、斑点杂交法检测SEN病毒感染论文杨群，田德英，许东，葛娅，任星峰，宋佩辉【关键词】聚合酶链反应【Abstract】AIM:ToexploretheavailabilityofdotblotassayinthedetectionofSENvirusinfection.METHODS:Nuclearacidserumspecimens,anddotblotanalysisandpolymerasechainreaction(PCR)ong191samples,6ples.【Keyerasechainreac

2、tion【摘要】目的：探讨斑点杂交法检测SEN病毒（SENV）感染的应用价值.方法：应用地高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENVDNA，与聚合酶链反应(PCR)检测结果相比较.结果：在191份血清中，采用斑点杂交法检出6份阳性.freeler:5′GAGTTTACACACCGCAG3′Antisenseprimer:5′GTCTTATGTACCGTCTCC3′；内引物为：Senseprimer:5′GGTGGCACGGGATCCAAAAATGCACTTTTC3′Antisense

3、primer:5′GGTGGCACGGATCCTAAAAATGCACTTTTC3′.通过套式PCR反应从患者血清中扩增得到长511bp片段，连接pRSETB载体，转化大肠杆菌.在挑取阳性克隆提取重组质粒进行测序鉴定后扩增重组质粒，以BamHⅠ单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，取1μg以博士德公司地高辛DNA标记和检测试剂盒进行标记，操作按试剂盒说明书进行.1.2.2血清样品DNA的提取病毒核酸抽提试剂为美国Biotronics公司AcupureDNA/RNA提取试剂盒,取50μL血清加100μL裂解液

4、充分混匀，80℃温浴10min,取出室温平衡5min，加150μL异丙醇混匀，经15000g10min离心沉淀，去除上清液，加50μL700mL/L乙醇试剂洗涤沉淀,再离心去除上清液，室温风干，加50μL样品稀释液重悬样品，80℃温浴5min,离心后将上清液备用.1.2.3PCR检测取各份提取核酸5μL作为模板加入第1次PCR反应体系.50μL反应体系中镁离子终浓度为15mmol/L,dNTP终浓度各为200μmol/L,TaqP为2u，外引物各为50pmol，以94℃变性3min，55℃退火1min，

5、72℃延伸3min，30个循环；取第1次PCR产物2μL加入第2次PCR反应体系，50μL反应体系中内引物各为50pmol，余同第1次PCR,循环参数同第1次PCR，共进行30个循环.PCR结束后收产物加于80g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，预期PCR产物应为511bp.1.2.4斑点杂交取各份提取核酸20μL及定量系列稀释重组质粒，煮沸10min后立即置于冰浴，加入等体积20×SSC，点样于硝酸纤维素膜上，以真空泵抽吸，80℃烤膜2h，参照试剂说明书进行杂交及链酶亲合素生物素过氧化物酶复合物(SABCPOD

6、),显色.探针浓度为25μg/L.2结果2.1斑点杂交检测结果检测标本共191份，其中6份为阳性，阳性率为3.1%.在同一张硝酸纤维素膜上，同时点上定量倍比稀释的SENV重组质粒（分别为625.0,125.0,.freeliD,,YaoCL.SENVDNAfoundinlivertissuefrompatientsiol,2003;24(1):33-35.［5］KaoJH,Chenplicationofanewlyidentifiedinfectiousagent(SENVirus)inTaiwan［J

7、］.InfectDis,2002;185:389-392.