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时间:2018-10-30
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1、Survivin与其异构体Survivin【关键词】膀胱癌Survivin;Survivin-2B异构体实时定量RT-PCRExpressionandclinicalsignificanceonsurvivinanditsisomersurvivin-2Binbladdercancer[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheexpressionofsurvivinmRNAanditsisomersurvivin-2BmRNAinbladdercanceranddiscussitspotentialclinicalsign
2、ificance.MethodsReal-timequantitiveRT-PCRRNA,survivin-2BmRNAin56casesofbladdermalignanttumortissuesand12casesofbladdernonmalignanttumortissues.ResultsMicrocrystallineexpressionsofsurvivinandsurvivin-2Balignanttumortissuesrespectively.Survivinandsurvivin-2Bexpressionsalignanttum
3、ortissues.Expressionofsurviviner;real-timequantitiveRT-PCRSurvivin是凋亡抑制蛋白家族IAPs(inhibitorofapoptosisproteins)中结构最简单,抗凋亡作用最强的蛋白分子,含有四个外显子和三个内含子,只含有一个杆状病毒IAP重复序列(baculoviralIAPrepeats,BIRs),BIR结构主要起抗凋亡作用。Mahotka等在1999年鉴定出Survivin的一种异构体Survivin-2B,Survivin-2B添加了被隐含外显子2B编码的23个氨基酸,该
4、外显子插入到Survivin的BIR区(外显子2和3之间)改变其三级结构及抗凋亡活性,在转染实验中发现Survivin-2B有明显降低抗凋亡的特性,并具有细胞毒性[1,2]。本研究通过运用实时定量PCR法检测膀胱癌组织中SurvivinmRNA及Survivin-2BmRNA的表达,并做定量分析,探讨它们在膀胱肿瘤发生、发展中的作用及临床意义。1对象与方法1.1研究对象选取2006年6月~2007年9月手术切除的原发性膀胱癌患者新鲜标本56例,男36例,女20例,年龄46~82岁,平均64岁。取同期膀胱非恶性肿瘤患者的膀胱病变组织标本12例(慢性膀胱
5、炎6例,腺性膀胱炎3例,内翻乳头状瘤3例)作为对照。标本均具有完整的病理资料。按MLV1.5μl,Rnasin0.5μl(Promega公司),dNTP0.5μl,H2O14.5μl,37℃1h,95℃5min,最后冷却至4℃,保存于-20℃备用。1.3实时定量RT-PCR反应以abl为内参,并设立空白对照。经内参均一化处理后,计算Survivin及Survivin-2BmRNA的相对表达量2-△Ct值。Survivin的上游引物:5′-TGCCTGGCAGCCCTTTC-3′,下游引物:5′-GCGCAGCCCTCCAAGAA-3′,survivi
6、n-2B[3]的上游引物:5′-GCACGGTGGCTTACGCCTG-3′下游引物:5’-AACCGGACGAATGCTTTTTATGTTCC-3′,TaqMan探针序列:5′-FAM-CAAGGACCACCGCATCTCTACATT-CAAGA-TAMRA-3′。abl内参的上游引物:5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′,下游引物:5′-ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG-3′,探针序列:5′-FAM-AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCAT-TAMRA-3′。反应条件:95℃5min预变性,95℃15s,
7、58℃25s,72℃25s,78℃0.1s,60℃~96℃0.3s融解曲线,72℃5min,共50个循环。实验重复3次。1.4PCR产物纯化及测序向膀胱肿瘤标本的Survivin-2BPCR产物中加入20mlDP洗脱液,37℃放置2min,离心回收DNA。将纯化后的DNA送至上海博亚公司进行测序。1.5统计学方法Survivin、Survivin-2B相对于内参abl表达量2-△Ct值以均数±标准差(x±s)表示,独立组间均数比较用Wilcoxon秩和检验,试验组内部组间采用Kruskal-an秩相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。数据由SPS
8、S11.5软件包完成。 2结果2.1试验组与对照组Survivin,Survivin-2B的表达量对照组中
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