长春新碱诱导肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素与bcl

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1、长春新碱诱导肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素与bcl【摘要】目的探讨长春新碱(VCR)诱导HepG2肝癌细胞自噬性凋亡过程中泛素表达的变化及阻断泛素蛋白酶体通路对此凋亡和bcl2表达的影响。方法应用VCR诱导HepG2细胞自噬性凋亡，采用流式细胞仪检测凋亡及泛素的表达；以RTPCR检测bcl2的表达。结果VCR处理后发生自噬性凋亡的HepG2细胞中泛素含量增加（P<0.01）。加用蛋白酶体特异抑制剂乳胞素后的乳胞素+VCR组凋亡率明显比单用VCR组高（P<0.01），而bcl2表达则比单用VCR组更低。结论泛素蛋白酶体通路参与了VCR诱导

2、的HepG2细胞自噬性凋亡及对bcl2蛋白的调控。对蛋白酶体功能的抑制可以促进VCR诱导的HepG2细胞凋亡。【关键词】长春新碱；泛素蛋白酶体通路；肝癌细胞；凋亡；bcl2Keyepathacell;Apoptosis;bcl2新近的研究显示泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasomepatha公司产品），即于培养液中加入1μg/mL的VCR去诱导。在药物作用不同时间后用0.125%胰蛋白酶EDTA消化收获细胞行以下实验。1.3泛素的定量检测分别将对照组、VCR作用4h组、VCR作用16h组的HepG2细胞经固定、漂洗后加1∶200

3、的抗泛素(博士德公司)，4℃过夜，加1∶64的IgGFITC(Sigma产品)于室温作用30分钟后用Elite流式细胞仪(COULTER公司)分别检测各组平均荧光强度。1.4bcl2表达的RTPCR检测1.4.1被检测细胞分三组：对照组、VCR16h组、乳胞素+VCR16h组。乳胞素(Lactacystin，CALBIOCHEM公司)为蛋白酶体的抑制剂，使用浓度为10μM[3]，细胞加用乳胞素8h后再加用VCR处理16h。1.4.2用Goldkey软件设计bcl2引物，由上海生物工程公司分别合成，bcl2扩增引物为sense:5′GGACAACAT

4、CGCCCTGTG3′(551～568);antisense:5′AGTCTTCAGAGAACAGCCAGGA3′(668～688),扩增片段为137bp；内参照GAPDH扩增引物为sense:5′GGTGAAGGTCGGTGTCAACG3′；antisense:5′caaagttgtcatgcatgacc3′，扩增片段为496bp。1.4.3RNA分离用Trizolreagent总RNA分离试剂盒(Gibco公司)从细胞中提取细胞RNA。1.4.4cDNA合成用THERMOSCRIPTRTPCRSystem试剂盒（Gibco公司）将分离的RNA逆转录成c

5、DNA。1.4.5PCR以此cDNA为模板行扩增反应。RTPCR反应体系：模板20μL,上游引物（10μmol/L）和下游引物(10μmol/L)各2μL，dNTP4μL(10mmol/L)，10×Taq多聚酶缓冲液10μL，TaqDNA聚合酶1μL(5u)。PCR循环参数为94℃，1.5min；52℃，1.5min；72℃，2.5min;44个循环后72℃，20min。1.4.6取PCR产物行电泳分析(电泳仪、电泳槽为BioRad公司产品)。以X174HincIIdigestDNAMarker(TaKaRaBiotech)为分子量参照。1.5细胞凋亡

6、率的FCM检测分别检测对照组、VCR4h组、VCR16h组、乳胞素+VCR16h组的细胞凋亡率：约1×106个各组细胞经固定、漂洗后加1%RNase37℃作用30分钟，随后分别加入PI(50μg/ml)避光染色；流式细胞仪测定DNA含量。低于G1期二倍体DNA含量的细胞为凋亡细胞。各组均测定10000个细胞，由流式细胞仪计算平均凋亡百分率，统计处理采用χ2检验。2结果2.1泛素及细胞凋亡率的FCM检测见表1。表1VCR各组抗泛素的FITC标记荧光平均荧光强度及凋亡率*:经F检验，P＜0.01;**:经χ2检验，P＜0.012.2VCR、乳胞素对HepG2细胞

7、bcl2的mRNA水平的影响两对引物进行RTPCR后获得137bp(bcl2)和496bp(GAPDH)两条带(见图1)，用凝胶图像分析仪分析电泳结果，各组bcl2与GAPDH的比值分别是：正常对照组为0.736，VCR组为0.241,乳胞素+VCR组为0.086。分析结果提示乳胞素+VCR组的bcl2mRNA水平比其他组有明显下降。2.3各组HepG2细胞凋亡率对照组、VCR16h组及乳胞素+VCR组的细胞凋亡率分别为4.1%、53.4%及87.6%。经χ2检验：P<0.01，各组间凋亡率差异有非常显著性。3讨论泛素通路是真核细胞内主要的蛋

8、白质降解系统。泛素表达于所有的真核细胞中，在ATP存