肝癌细胞自噬性凋亡过程中caspase3基因

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1、肝癌细胞自噬性凋亡过程中caspase3基因【摘要】目的从长春新碱诱导发生自噬性凋亡的肝癌细胞系HepG2中克隆caspase3基因。方法提取细胞总RNA,采用RTPCR技术扩增目的片段，构建重组克隆载体，测序鉴定及分析。结果经RTPCR获得了预期的扩增产物即caspase3基因625bp的核苷酸片段，其测序结果与文献报道一致。结论初步证明该caspase3基因片段参与了长春新碱诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程。【关键词】HepG2肝癌细胞系；自吞噬作用；细胞凋亡；长春新碱；caspase3基因细胞自噬（autophagy）与细胞凋亡（ap

2、optosis）的调控机制有关，除了凋亡以外，自噬也可能是一种肿瘤抑制机制[1]。有着明显自噬特征的细胞凋亡称为“自噬性凋亡”（autophagicapoptosis）[24]。现认为caspase蛋白酶家族中的caspase3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[5]。本研究采用抗肿瘤药长春新碱（vincristine,VCR）诱导人肝癌细胞系HepG2自噬性凋亡，在此凋亡模型[4]基础上，试图从发生自噬性凋亡的细胞中克隆并鉴定caspase3基因，以研究长春新碱诱导的自噬性凋亡是否也与caspase3有关。1材料和方法1.1细胞及培养人肝癌细胞系He

3、pG2细胞（购自上海中科院细胞所）用含10％小牛血清的RPMI-1640(GibcoBRL)常规培养。1.2细胞分组与加药处理细胞分3组：未加药对照组（药物为零剂量）、VCR（sigma）作用4h组、VCR作用16h组。VCR组的药物处理基本同文献[5]之自噬性凋亡细胞模型制作，即于培养细胞中加入1μg·ml-1的VCR进行诱导。各组分别于药物作用4h、16h后收获细胞继续以下实验。1.3RNA分离以TRIzolReagentRNA分离液(GIBCOBRL)提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定浓度后，将RNA样品作电泳质量分析后备用。1.4caspase

4、3基因PCR引物的设计及合成从“GeneBank”中查得的caspase3基因cDNA序列[6]，应用引物设计软件“OligoDNA/RNAPrimerAnalysisSoft逆转录提取的RNA成cDNA；以之为模板行PCR，PCR循环参数为94℃，4min→94℃，1min；52℃，1min；72℃，3min；共40个循环后→72℃，5min。运用GAPDH作为内对照以半定量估计caspase3mRNA在总RNA中的水平。1.6PCR反应产物电泳分析以X174HincⅡdigestDNAMarker为分子量参照，电泳2h后溴乙锭染色，紫外透射仪上

5、观察照相。1.7序列分析回收RTPCR产物,与pGEMTvector质粒重组，抽提质粒，以重组质粒DNA为模板,3700BigdyeTerminator测序系统用M13正反向引物从两端行目的片段序列测定。经计算机DNASIS软件和BLAST软件根据GeneBank资料对目的DNA测序结果进行分析及基因同源性比较。2结果2.1总RNA电泳从细胞中提取的总RNA经电泳鉴定可见清晰的18s、28s两条带。2.2PCR扩增产物电泳取PCR扩增产物电泳，结果可见两条清晰的扩增条带，一条为496bp的GAPDH内对照扩增产物带；另一条为目的基因扩增片断，大小为

6、625bp，其片断大小与我们设计的理论预计值相符，未见非特异扩增带，见图1。M：分子量标准；C：未加药对照组；4h：VCR4h组；16h：VCR16h组。GAPDH分子量大小为496bp图1caspase3mRNARTPCR扩增产物的电泳鉴定2.3PCR扩增片段核苷酸序列测定结果对扩增片段测序结果测出625bp核苷酸片段，与设计的引物间核苷酸片段长度一致。2.4核苷酸序列同源性检索及比对引物间核苷酸序列与Genebank报道的caspase3序列（检索号为NM_004346）同源性为100%。用Blast软件行序列分析结果显示引物间核苷酸序列与报道的

7、CPP32β/Yama(caspase3)cDNA序列完全一致，见图2。3讨论经过一系列研究，认为“自噬性凋亡”是细胞凋亡的一种特殊类型，自噬性凋亡有着明显的自噬特征[24]。其他一些学者也对细胞凋亡作了类似的分类，并认为自噬才是这类细胞凋亡的真正原因[7]。现普遍认为半胱天冬酶类(caspases)是凋亡信号传导的共同通路，该蛋白酶家族成员之一的caspase3在其中起着核心作用[5]。为了阐明长春新碱诱导的自噬性凋亡是否也依赖于caspases，进行了上述实验，在已建立的长春新碱诱导HepG2细胞自噬性凋亡之细胞模型基础上，试图从发生自噬性凋亡的

8、细胞中克隆caspase3基因。长春新碱属于长春碱类抗肿瘤药，据