巢式msp检测砷剂诱导人多发性骨髓瘤u266细胞

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1、巢式MSP检测砷剂诱导人多发性骨髓瘤U266细胞【摘要】本研究探讨用高灵敏度的DNA甲基化检测方法及DNA克隆测序分析法检测三氧化二砷（As2O3）的去甲基化作用，并对其可能的去甲基化作用机制进行分析。采用巢式甲基特异性PCR法（nestedmethylationspecificPCR，nMSP）、DNA克隆测序分析法检测As2O3作用前后U266细胞株p16基因甲基化状态，应用RTPCR检测p16、DNA甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达，以生长曲线、MTT法、集落形成实验检测As2O3对骨髓瘤细胞生长和增殖的抑制作用

2、。利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨As2O3对多发性骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果表明：①未处理组U266细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经As2O3作用的U266细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶，这说明U266细胞存在p16基因甲基化，As2O3作用后p16基因异常甲基化的现象被逆转；②未处理组细胞p16基因不表达，As2O3作用72小时后p16基因表达增强，0.5μmol/L组、1.0μmol/组和2.0μmol/组p16基因表达阳性条带灰度值与β肌动蛋白比值分别为(0.22±0.10)、(0.59±0.11)、(0.68±0.09)，阳

3、性对照灰度比值为(0.77±0.13)，差异有非常显著的统计学意义（P<0.01）；③与未处理组相比，As2O3作用72小时后甲基转移酶（DNMT）1、DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性；④与对照组相比，3组不同浓度As2O3均能明显抑制骨髓瘤细胞生长，G0-G1期细胞增加。结论：As2O3可能通过抑制甲基转移酶（DNMT1）、DNMT3A、DNMT3B和（或）直接对p16基因去甲基化，使p16基因表达上调，恢复其活性，从而实现其对细胞周期的调控功能，将细胞阻滞于G0-G1期，抑制骨髓瘤细胞的增长。【关键词】巢式MSPp16基因去甲基化三氧化

4、二砷多发性骨髓瘤U266细胞甲基转移酶nMSPDetectionofp16GeneDemethylationandTranscriptioninHumanMultipleMyelomaU266CellLineInducedbyArsenicTrioxideAbstractThestudyethylationbyasensitiveandspecificPCRbasedmethod(nestedmethylationspecificPCR,nMSP)andDNAsequencingforrapidanalysisofthepromoterdemethylat

5、ionstatus,andtoexplorethepossiblemechanismofthep16genedemethylationinhumanmultiplemyelomaU266cellsinducedbyAs2O3.Themethylationstatusofthep16geneinU266celllinebeforeandaftertreatmentethylationspecificPCRandDNAsequencing,themRNAofp16,DNAmethyltransferase(DNMT1、DNMT3Aand3B)geneinedbyRT

6、PCR,andtheinducedgroetryafterbeingexposedtoAs2O3.Theresultsshoidine.(2)p16geneethylation.AsparedRNAol/L、1.0μmol/Land2.0μmol/LAs2O3for72hoursrespectively.(3)As2O3couldsignificantlydoethyltransferase1(DNMT1)、DNMT3AandDNMT3BgeneatmRNAlevelinadosedependentmanner.(4)U266cellslinegreenteth

7、ylationor/andbyinhibitingDNMT1、DNMT3Aand3Bgene.近年来的研究显示，DNA的异常甲基化是一种与肿瘤发生密切相关的表遗传学机制,其启动子区CpG岛的异常甲基化已成为抑癌基因表达失活的一条重要途径。据报道，人骨髓瘤U266细胞系由于CpG岛的甲基化,而导致该细胞系p16基因表达失活［1］。我们以人骨髓瘤（MM）细胞株U266为对象，用巢式甲基特异性PCR法（nestedmethylationspecificPCR）、TA克隆及DNA序列分析、RTPCR等方法研究三氧化二砷（As2O3）对人骨髓瘤U266细胞株p16基因

8、的去甲基化