腺病毒穿梭质粒pshuttle cmv

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1、腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV【摘要】目的构建腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV-+VEGF121-IRES-hrGFP-1，为构建表达具有抗原表位标记的血管内皮生长因子121(vascularendothelialgroeraseChainReaction，PCR)技术对pTG19T-VEGF121携带的VEGF121基因突变，以去除翻译终止密码子后的基因序列并在序列前后分别添加新的NotI和XhoI酶切位点。将突变后的VEGF121基因(+VEGF121)定向连入腺病毒穿梭质粒pSh

2、uttleCMV-IRES-hrGFP-1，通过电泳和测序鉴定获得的重组质粒。结果重组质粒经电泳和测序鉴定为正确克隆。结论成功构建了pShuttleCMV-+VEGF121-IRES-hrGFP-1。【关键词】腺病毒穿梭载体;血管内皮生长因子121Abstract:ObjectiveToclonevascularendothelialgroidpShuttleCMV-IRES-hrGFP-1,preparingforconstructionofanovelrebinantadenovirusve

3、ctorexpressingtheVEGF121fusedtoFLAGepitopeandhumanizedRenillareniformisgreenfluorescentprotein1(hrGFP-1)asareporteronthesametranscript.MethodsTheVEGF121genecontainedintheplasimidofpTG19T-VEGF121oved.Meanutantthroughpolymeraschainreaction(PCR)mutagene

4、sistechnology.ThemutantofVEGF121gene(+VEGF121gene)ultiplecloningsitesoftheadenovirusshuttleplasmidpShuttleCMV-IRES-hrGFP一1bythedirectionalcloningmethod.ToidentifythecorrectrebinantstheanalysisofsequencingandelectrophoresisapoftherebinantaccordedidpSh

5、uttleCMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1hasbeenconstructedsuccessfully.　　Keyid;vascularendothelialgroRNA编码序列可产生六种不同的异构体，其中其中以VEGF165和VEGF121的作用最为显著，但由于VEGF165以一半可溶性，一半不可溶性蛋白在机体内表达，可分泌到细胞外，但一部分与细胞膜或细胞间质结合，而VEGF121则全部为可溶性，不结合于肝素的弱酸性蛋白质，完全分泌到胞外并游离于细胞间质，可以更好的发挥旁分泌的

6、作用，促进血管生成[6]。本实验利用hrGFP-1为报告基因，构建含VEGF121和hrGFP-1基因的穿梭载体，为进一步研究VEGF121在体内的表达和促血管生成及成骨的活动打下基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1质粒和菌株pTG19T-VEGF121质粒购自上海东方肝胆外科研究所;腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1购自Stra-tagene公司;pMD19-T和大肠杆菌感受态DH5α购自TaKaRa公司。　　1.1.2主要试剂、试剂盒各种限制性内切

7、酶、DNALigationKitVer.2.0、高保真DNA聚合酶、AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0、TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer.2.0质粒小量提取试剂盒、dNTP、DL15000等购自TaKaRa公司。　　1.2方法　　1.2.1VEGF121基因的突变及携带突变后VEGF121基因(记作+VEGF121)的pMD19-T质粒的亚克隆：①以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去

8、除VEGF121基因中终止密码子TAG序列，之后在基因序列前后分别加入NotI和XhoI酶切位点：引物序列：　　F:5′-GCGGCCGCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3′　　R:5′-CTCGAGCCGCCTCGGCTTGTCACATT-3′　　以pTG19T-VEGF121为模板，进行PCR反应，反应条件：98℃，10s,30cycles;55℃,5s,3030cycles;72℃,30s,30cycles;72℃,5min,1cycles，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②PCR产物加“A