人ddr2基因pshuttlecmv穿梭载体的构建及表达

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1、人DDR2基因pShuttleCMV穿梭载体的构建及表达作者：任婷婷，刘新平，车红磊，张健，张璟，李霞，苏金【摘要】目的：构建带有flag标签的人DDR2pShuttleCMV载体，检测其真核表达并观察DDR2分子的亚细胞分布.方法：以含有人全长DDR2cDNA的质粒为模板，用PCR方法扩增DDR2基因的C端（DDR2C），并在其C末端带上含24bp的flag标签，NcoI/EcoRV酶切后亚克隆入含有DDR2全长序列的pMD18T载体，即替换掉原有DDR2序列的C端，引入flag标签，测序正确后再克隆入pShuttleCMV表达载体，酶切鉴定正确后采用脂

2、质体法瞬时转染HEK293细胞，V载体构建符合预期；脂质体法转染HEK293细胞，24h后用MP1，MMP8，MMP13）的表达［1-2］.DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平，而其所活化的下游分子中，特别是MMP13对关节软骨的主要成分II型胶原的降解能力高于其他胶原酶，因此认为“Ⅱ型胶原DDR2MMPs”通路中的关键分子可能成为减轻RA关节软骨破坏的药物作用靶位［3］.然而目前有关此通路的研究报道甚少，我们构建C末端融合flag标签的人DDR2基因真核表达载体，旨

3、在为进一步研究DDR2信号通路在RA中的影响奠定基础.　　1材料和方法　　1．1材料大肠杆菌菌株XL10，pcDNA3.1(+)真核表达载体，含人全长DDR2cDNA的质粒，HEK293细胞及Hela细胞由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存.dNTP，dATP，pfu高保真聚合酶，TaqDNA聚合酶，各种限制性内切酶，pMD18T载体，T4DNA连接酶，DL2000DNAmarker（日本TaKaRa公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）；抗flagM2mAb（美国Sigma公司）；抗

4、DDR2抗体及FITC标记的羊抗鼠第二抗体（美国SantaCruz公司）；D18T载体，后者用于将带有flag标签的DDR2全长序列亚克隆入pShuttleCMV载体，下划双线部分为编码flag标签的核苷酸序列.　　1．2．2PCR扩增DDR2C（含flag）基因及产物修饰扩增条件为94℃5min，94℃40s，55℃40s,72℃1min，30个循环.产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收后进行加“A”反应：72℃40min.　　1．2．3PCR产物克隆及序列测定加“A”后的PCR产物回收，克隆到pMD18T载体，转化大肠杆菌XL10感受态细胞，挑选阳

5、性克隆进行酶切鉴定并测序.　　1．2．4DDR2全序列拼接及鉴定用NcoI/EcoRI双酶切DDR2C/pMD18T，得到含flag的DDR2C端，置换出pMD18T载体中不含flag标签的DDR2C端，并进行酶切鉴定，即在pMD18T载体中完成含有flag的新DDR2全长序列的拼接.　　1．2．5真核表达载体的构建用HindIII/EcoRV/ScaI三酶切含有拼接DDR2序列的pMD18T载体，其中HindIII/EcoRV可切下完整的DDR2序列（2568bp），ScaI将余下的pMD18T载体(2692bp)切割为两个小片段(924bp+1768

6、bp)，便于电泳分离.　　1．2．6基因转染HEK293细胞在含100mL/L新生小牛血清的DMEM培养基中，于37℃，50mL/LCO2饱和湿度下培养，80％汇合时按照Lipofectamine2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染.　　1．2．7EM培养基中，于37℃，50mL/LCO2饱和湿度下培养，80％汇合时按照Lipofectamine2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染，于转染24h后收细胞，40mL/L多聚甲醛4℃固定15min，10mL/LTritonX100室温孵育10min，用含10mL/LBSA的一抗（1∶100稀释）4℃过夜，F

7、ITC标记的二抗（1∶100稀释）室温孵育2h，核染料PI37℃孵育5min，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察.　　2结果　　2.1DDR2C（含flag）片段的扩增、克隆及序列分析DDR2C（含flag）的PCR产物为937bp的特异性条带（图1A）.测序结果经Blast分析表明，PCR扩增获得并克隆的DDR2C片段序列完全正确.通过位于片段内的BamHI与T载体多克隆位点处的HindIII进行双酶切，可切出预期大小的片段，分别为343，594，2692bp的三条带（图1B）.　　图1PCR产物及重组载体的鉴定　略　　2.2DDR