采用issr分子标记法鉴别道地药材化橘红

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1、采用ISSR分子标记法鉴别道地药材化橘红【摘要】目的探索用ISSR分子标记方法在核酸分子水平上鉴别道地药材化橘红。方法从20条ISSR引物中筛选合适的引物对化橘红、橘子、柚子等共16个样品进行PCR扩增及电泳分析，寻找特征位点。结果有2条ISSR引物扩增出较为明显的多态性特征条带，可单独或联合应用鉴别化橘红。结论ISSR作为一种简便、可靠的分子标记方法，可用于化橘红的鉴别。【关键词】化橘红；ISSR；分子标记技术　　Abstract:ObjectiveToidentifyExocarpiumCitriGrandisbyinter-simplesequencerepeatmarker

2、s.MethodsPrimerssuitableforroutineanalysis20intersimplesequencerepeatprimers,then,theyplesofExocarpiumCitriGrandis,CitrusreticulataandCitrusgrandis（Linn.）Osbeck.ResultsTersamplifiedpolymophicbandsandsuitablefortheidentificationofExocarpiumCitriGrandis.ConclusionIntersimplesequencerepeatmarke

3、rsprovideaquick,reliablemolecularmarkerforidentificationofExocarpiumCitriGrandis.　　KeyCitriGrandis;intersimplesequencerepeat;identification　　化橘红（ExocarpiumCitriGrandis）是芸香科植物柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，通称柚皮橘红、化州橘红、柚子皮。柚的栽培变种化州柚Citrusgrandis“Tomentosa”的外层果皮同作化橘红入药。药材呈对折的七角或展开的五角星状，

4、单片呈柳叶形，气芳香，味苦、微辛，具有散寒，燥湿，利气，消痰等功效。主产于广东、广西、四川、湖南、湖北、浙江，其中以广东化州产最为道地。　　利用ISSR（intersimplesequencerepeat，简单序列重复区间）分析是基于PCR的分子标记技术，最早由ZietkieCitriGrandis。作为易混用品进行比较分析，另采集新鲜橘子皮2批（高州产，编号J1、J2，经广东省药检所中药室莫结丽副主任药师鉴定为芸香科柑桔属Citrusreticulata）、柚子皮4批［梅州产编号Y1，广西产编号Y2、Y3，海南产编号Y4，经广东省药检所莫结丽副主任药师鉴定为芸香科植物Citru

5、sgrandis(Linn.)Osbeck］，共计16批样本。　　1.2试剂　　　　Tris、β巯基乙醇购自SIGMA公司；PCRBuffer、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTPs购自广州威佳生物技术有限公司及宝生物有限公司；超纯水、DGL2000DNAMarke购自北京鼎国生物公司；琼脂糖购自广州宝泰克生物科技有限公司；ISSR引物由上海生工生物技术服务公司合成。其余试剂均为国产分析纯试剂。　　1.2.1总DNA提取液　　三水合乙酸钠6.8g，十二烷基磺酸钠7g，聚乙烯基吡咯烷酮10g，乙二胺四乙酸二钠9.3g，氯化钠14.6g，加水定容至500mL，用NaOH（1mol/

6、L）调pH至5.5，灭菌备用。　　1.2.2KAc溶液(2.5mol/L，pH4.8)　　取醋酸钾122.7g，加水定容至500mL，用冰醋酸调pH至4.8，灭菌备用。　　1.2.31×TE缓冲液　　取Tris（1mol/L）1mL，EDTA（0.5mol/L）0.2mL，加水定容至100mL。　　1.3仪器　　　　EppendorfMiniSpin离心机（德国Eppendorf公司）；9700型PCR仪（美国ABI公司）；PoL离心管中，立即加入预冷至-20℃的丙酮1mL，振摇约5min，9000r/min离心6min；弃上清液，加入预热至65℃的总DNA提取液1mL，置65℃水

7、浴中1h，期间不时振摇，取出，9000r/min离心5min；取上清液，加0.5mL苯酚异戊醇（体积比24∶1），混匀，至冰浴中放置10min，期间不时振摇，取出，15000r/min离心6min；取上清液，加入2/3体积的KAc溶液（2.5mol/L，pH4.8），混匀，冰浴20min，15000r/min离心10min；取上清液，加入2/3体积的KAc溶液（2.5mol/L，pH4.8）同上操作，重复1次；取上清液，加入2/3体积的预冷至-20℃异丙醇，混匀，置