滑液囊支原体环介导等温扩增技术检测方法的建立与初步应用

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1、分类号：S855.1学校代码：10712UDC：636.09研究生学号：2016051659密级：公开2018届专业学位硕士研究生学位（毕业）论文滑液囊支原体环介导等温扩增技术检测方法的建立与初步应用类型兽医硕士领域、方向预防兽医学研究生寇艳利指导教师王晶钰教授完成时间2018年5月中国陕西杨凌Classificationcode:S855.1Universitycode:10712UDC:636.09Postgraduatenumber:2016051659Confidentialitylevel:PublicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆F

2、Universityin2018ESTABLISHMENTANDPRELIMINARYAPPLICATIONOFDIAGNOSTICMETHODSFORLOOP-MEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONOFMYCOPLASMASYNOVIAEMajor:MasterofVeterinaryMedicineResearchfield:PreventiveVeterinaryMedicineNameofPostgraduate:KouYan-liAdviser:WangJing-yuDateofsubmission:May2018YanglingShaanxiCh

3、ina滑液囊支原体环介导等温扩增技术诊断方法的建立与初步应用摘要滑液囊支原体（MycoplasmaSynoviae，MS）能引起蛋鸡严重的关节肿胀，导致蛋鸡产蛋量下降。自2011年开始，蛋鸡滑液囊支原体感染开始在中国流行性感染。近年来，随着感染面积逐步扩大，对家禽养殖业造成巨大的经济损失。本研究从关节肿胀的病鸡中分离出滑液囊支原体，使用PCR特异性引物，检测结果为滑液囊支原体阳性。经序列比对后发现该分离株（MSShaanxi2017）与2016年印度发现的分离株MycoplasmaSynoviaestrainpal1216SrRNA片段相似性达到100%，故确定该分离菌株属于MS。

4、基于GenBank公布的MS基因编码区序列设计两对LAMP引物。根据LAMP操作指南建立了针对MS的LAMP检测方法，并比较该方法与普通PCR检测方法的敏感性、特异性。试验结果如下：1.采集疑似MS感染鸡的关节渗出液棉拭子，适当处理后接种到改良Frey氏培养基中，24h以后传到新的改良Frey氏培养基中，经过37℃的厌氧环境48~72h培养，培养基颜色由橘红色变为黄色，并且将液体培养基中的分离菌接种到普通鲜血琼脂平板上观察，结果显示无细菌生长，说明该分离菌不是细菌。将已经变黄的培养液挑取到载玻片上，经姬姆萨染色，在100倍油镜下观察到分离菌的形态呈不规则的椭圆形，说明该分离株为MS

5、。2.根据所建立的PCR反应体系，将培养液经过特殊处理后直接作为模板DNA，用MS特异性引物检测，扩增得到一条207bp大小的特异性条带，且阴性对照成立，证明所检测的样品中含有滑液囊支原体。回收阳性PCR产物并将其连接到T载体上，将测序结果与NCBI数据库上所公布的MS16SrRNA进行比对，分离株（MSShaanxi2017）与2016年印度发现的分离株MycoplasmaSynoviaestrainpal1216SrRNA片段相似性达到100%，故确定该分离菌株属于MS。3.本试验根据MS编码区基因设计两对LAMP扩增引物，通过BstDNA聚合酶的链置换作用使之进行扩增，在反应

6、结束后加入SYBRGreenI核酸染料，根据颜色变化判断结果的阴阳性。本试验针对MS所建立的LAMP检测方法的反应体系进行温度及时间的条件优化，结果显示：最佳的反应温度为63℃，最佳的反应时间为70min。此外，本试验对所建立的LAMP检测方法进行了敏感性、特异性验证。通过试验证实，LAMP检测方法有较好的敏感性与特异性。最后，分别对20份样品进行检测，使用LAMP检测方法检出10份，普通PCR检出7份。关键词：滑液囊支原体（MS）；序列比对；鸡；环介导等温扩增技术；PCR检测ESTABLISHMENTANDPRELIMINARYAPPLICATIONOFDIAGNOSTICMET

7、HODSFORLOOP-MEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONOFMYCOPLASMASYNOVIAEABSTRACTMycoplasmaSynoviae(MS)cancauseseverejointswellinginlayinghens,leadingtodecreasedeggproductioninlayinghens.Since2011,eggsyringomyeliainfectionshavebeguninChinawithepi