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1、第6章CpLTP3、CpITP/j基因启动子克隆及瞬时表达分析为了深入探索蜡梅nsLTPs基因家族4个成员CpLTPl、CpLTP2、CpLTP3、C/儿7P4在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以便寻找调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR法分离得到了CpLTP3、CpLTP4基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。6.1实验材料6.1.1植物材料供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内，常规管理。蜡梅小苗
2、通过种子繁殖培育，种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度85%,16h光照（2000Lx）,温度25°C,8h黑暗,温度20°C。烟草W38（Nicotianatobacumcv.Wisconsin38）由本实骑室保存扩繁。大肠打•菌QEsherichiacoli）菌株TOP10，为质粒转化受体菌由本实验室保存。根癌农打菌CAgrobacteriumtumefacieus）LBA4404，用于农杆•菌介导的烟草遗传转化，由本实验室保存。克隆载体PMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性
3、和完整的Gt/S基因表达元件，用于构建瞬时表达载体。6.1.3主要试剂TaqDNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2、dNTP、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司；DL2000、DNAMaker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成；氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）和卡拉霉素（Kanamycin,Km）均购自上海生物工程有限公同。6.1.4主要设备紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI）,台式冷冻离心机（Eppendoff）,TGL
4、-16B型台式离心机（上海安亭），EppendorfPCR仪，IKA型涡旋器（德国产），高压火菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYYIII型电泳仪（北京六一厂），超净工作台（苏州净化设备厂），FR-1型凝胶成像系统（上海第6章CpLTP3、CpITP/j基因启动子克隆及瞬时表达分析为了深入探索蜡梅nsLTPs基因家族4个成员CpLTPl、CpLTP2、CpLTP3、C/儿7P4在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以便寻找调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR法分离得到了CpLTP3、
5、CpLTP4基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。6.1实验材料6.1.1植物材料供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内，常规管理。蜡梅小苗通过种子繁殖培育，种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度85%,16h光照（2000Lx）,温度25°C,8h黑暗,温度20°C。烟草W38（Nicotianatobacumcv.Wisconsin38）由本实骑室保存扩繁。大肠打•菌QEsherichiacoli）菌株TOP10，为质粒转化
6、受体菌由本实验室保存。根癌农打菌CAgrobacteriumtumefacieus）LBA4404，用于农杆•菌介导的烟草遗传转化，由本实验室保存。克隆载体PMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性和完整的Gt/S基因表达元件，用于构建瞬时表达载体。6.1.3主要试剂TaqDNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2、dNTP、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司；DL2000、DNAMaker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成
7、；氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）和卡拉霉素（Kanamycin,Km）均购自上海生物工程有限公同。6.1.4主要设备紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI）,台式冷冻离心机（Eppendoff）,TGL-16B型台式离心机（上海安亭），EppendorfPCR仪，IKA型涡旋器（德国产），高压火菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYYIII型电泳仪（北京六一厂），超净工作台（苏州净化设备厂），FR-1型凝胶成像系统（上海复日），722型分光光度计（重庆川仪九厂），恒温振荡摇床，恒温培养箱，
8、水浴锅。6.1.5常用溶液配方氨苄青霉素（Amp）:水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL,-20°C避光保存。卡那霉素（Km）:水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL，-2（TC避光保存。TE（pH8.0）：10mmol/LTris-Cl（pH8.O）,lmmol/LEDTA（pH8.O）。50
