AHI基因启动子的克隆及转录活性的鉴定课件.pptx

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1、研究背景Joubert综合征常染色体遗传病临床表现：小脑共济失调，双眼运动不能，肌张力减弱；病因：发育过程中小脑齿状核和皮质脊髓束的神经元轴突不能穿越中线形成神经交叉。立论依据动物实验：小鼠同源基因Ahi1在小脑齿状核和深部第五层皮层神经元中高表达，齿状核神经元轴突穿越中线，参与形成小脑上脚；而深部皮层神经元的轴突形成皮质脊髓束．当Ahi1基因发生突变，小脑齿状核神经元和深部皮层神经元的轴突则不能穿越中线，表现出Joubert综合征；研究表明：Joubert综合征家系的患者有AHI1基因的移码突变和

2、错义突变；结论：AHI1基因在皮质脊髓束和小脑齿状核神经元穿越中线的过程中发挥着重要作用。AHI1基因基因结构：6q23.2，含有28个外显子表达部位：成年人小脑和大脑皮质中高表达当前进展：至今AHI1基因的表达调控机制尚不清楚.．研究内容：本课题拟通过研究AHI1的转录调控机制，以揭示Joubert综合征的发生机理和神经系统发育过程中神经元穿越中线的分子机制．研究方法利用生物信息学软件预测分析转录调控信息利用基因工程方法验证不同长度AHI15’端侧翼序列是否具有启动调控活性在生物信息学基础上，以E

3、MSA法分析与之结合的因子将已克隆入pEGFP-1的AHI1转录活性序列及与之结合的调节因子ORF的重组子共转染细胞，通过分析荧光蛋白活性分析反式作用因子对AHI1转录的影响技术路线㈠预测AHI1基因的转录调控信息①在Genbank中找到AHI1的基因组序列(No.NT_025741)②利用Promoter2.0,Genescan等软件分析AHI1基因序列，预测启动子的位置．③用CapsiteHunting法确定转录起始位点．㈡重组克隆不同长度的5’端侧翼序列①根据预测的启动子位置设计上游下游引物。

4、②通过PCR扩增含有启动子的不同长度5’端侧翼序列。③以pEGFP-1质粒为载体，重组克隆不同长度5’端侧翼序列．㈢转染真核细胞cos-7，通过分析绿色荧光蛋白表达的有无和亮度确定具有转录活性的序列．5‘端侧翼序列①阴性对照组：pEGFP-1②阳性对照组：pEGFP-N1③实验组：AHI1-pEGFP-1㈣通过生物信息学分析能与具有转录活性的序列相结合的调节因子，以EMSA法验证．EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,电泳迁移率实验)㈤将分别含有调节因子ORF

5、和调控活性序列的重组子共转染cos-7，通过分析绿色荧光蛋白表达的有无和亮度，分析调节因子对AHI1基因转录的影响．实验设计：①对照组：含AHI1启动子序列的重组pEGFP-1转染COS-7②实验组：AHI1启动子序列的重组pEGFP-1编码调节因子ORF的重组子共转染COS－7预期结果⒈确定AHI1转录起始位点⒉克隆出AHI15’端转录调控序列⒊找到能与转录调控序列相互作用的反式作用因子，并进一步阐明AHI1的表达调控机制谢谢！