血红蛋白的提取和分离

《血红蛋白的提取和分离》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、w.w.w.k.s.5.u.c.o.m专题5　DNA和蛋白质技术课题3　血红蛋白的提取和分离一、课题目标本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。二、课题重点与难点课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。三、课题背景分析课题背景通过当今生物科学在蛋白质研究领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，

2、进而明确地提出课题目的：以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。四、基础知识分析与教学（一）凝胶色谱法知识要点：1.凝胶色谱法的用途；2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理。教学：在介绍凝胶色谱法的基本原理时，可以结合教科书提供的插图，让学生对凝胶色谱法分离蛋白质的过程有一个直观的认识。可以通过发动学生查阅资料，让学生了解有关凝胶色谱法的知识，

3、如凝胶的种类、理化性质及凝胶的选择和保存，并结合实验操作，让学生分析实验中的注意事项。还可以向学生介绍凝胶色谱法的其他用途，如测定生物大分子的分子量、蛋白质的脱盐等。（二）缓冲溶液知识要点：1.缓冲溶液的组成和作用机理；2.熟悉一般缓冲溶液的配制方法；3．缓冲溶液广泛应用于生化实验、微生物的培养、组织切片和细菌染色以及酶的研究等方面。教学：首先可以结合生活中的一些缓冲现象，让学生充分理解缓冲溶液的重要性。在进行本课题的实验操作之前，可以让学生查阅相关资料，练习一些常用缓冲液的配制。（三）电泳知识要点

4、：1.电泳的基本原理；2.不同类型的电泳。教学：电泳技术广泛应用于生化实验，在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子方面具有较高的分辨率。可以通过一个简单的实验使学生理解电泳现象，比如在盛有红褐色Fe(OH)3胶体的U形管的两个管口，各插入一个电极。通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐变深，阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下，带电粒子发生迁移的现象就叫做电泳。教科书中用楷体字简单地介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，可以结合资料，开

5、拓学生的知识面，围绕聚丙烯酰胺凝胶电泳，介绍其他类型的电泳原理及应用。本实验的选做部分是通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对血红蛋白进行纯度的鉴定，同时也可以测定血红蛋白亚基的分子量。此外，还可以通过聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳来测定天然蛋白的分子量；通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳来测定蛋白的等电点；等等。相关原理可以查阅生物化学技术的有关书籍。使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准

6、曲线，可以测出未知蛋白的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。五、实验安排及注意事项（一）第1课时完成基础知识的教学。需要用简单直观、通俗易懂的方式讲解凝胶色谱法和电泳的基本原理。可以根据学生的接受情况，适当增加一些相关知识的教学，加深对本课题的理解。第1课时还要学习缓冲溶液的配制。本课题所用的缓冲液是20mmol/L的pH7.0的磷酸缓冲液。在pH5.8～8.0的缓冲范围内，磷酸缓冲液的配制方法见下表。配制前需要准备0.2mol/L的Na2HPO4溶液和0.2mol/L

7、的NaH2PO4溶液。Na2HPO4溶液的配制方法：将71.64g的Na2HPO4·12H2O溶解在1000mL的蒸馏水中。NaH2PO4溶液的配制方法：将31.21g的NaH2PO4·2H2O溶解在1000mL的蒸馏水中。pH0.2mol/LNaH2PO4/mL0.2mol/LNaH2PO4/mLpH0.2mol/LNaH2PO4/mL0.2mol/LNaH2PO4/mL5.86.06.26.46.66.88.012.318.526.537.549.092.087.781.573.562.551.

8、07.07.27.47.67.88.061.072.081.087.091.594.739.028.019.013.08.55.3（二）第2课时进行凝胶色谱柱的制备。教材中已经详细地介绍了凝胶色谱柱的制作，可根据学生小组的数目，课前准备好所需的材料。值得一提的是，凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果，但是直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此应选择直径不超过2cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关，一般不超过1m。在装填凝胶前，一定要按教材描述的方法