血红蛋白的提取和分离1

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1、第5．3血红蛋白的提取和分离【学习目标】凝胶色谱法的原理和方法样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填【基础知识预习】1．凝胶色谱法凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。2．缓冲溶液缓冲溶液的作用是。缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在

2、一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。3．电泳电泳是指。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。4．蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。【教学过程】【课题背景】

3、：新华网首尔１２月２９日电（记者干玉兰）韩国浦项工业大学科学家２９日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“ＴＲＩＭ５”蛋白质核心部分的结构。浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“ＴＲＩＭ５”蛋白质内核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期《分子细胞》杂志上。2００４年英国《自然》杂志曾刊登论文说，“ＴＲＩＭ５”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科学家开始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。对蛋白质的研究有助于

4、人们对生命过程的认识和理解。通常科学研究需要获得纯度较高的蛋白质。怎样才能从复杂的混合物中提取和纯化蛋白质呢？基础知识：通过DNA的提取与鉴定，你有没有关于分离大分子的思路呢？1、凝胶色谱柱的结构：工作原理：凝胶色谱柱的制作：(根据P68页内容，总结其制作步骤)讨论：根据此项操作的目的，你认为大分子在分离的过程中经过的路程长还是短？我们应该什么时候进行收集？2．在洗脱的过程中，蛋白质的活性很可能受到外界环境的影响而变性，那么对洗脱液有何要求？3、凝胶色谱法分离后可以去除相对分子量较大或较小的杂质，获得的蛋白质纯度如何检测？实验操作：1．1初步获取血红蛋白的原理和方法

5、【思考】：1、采集的血液如何才能防止凝固？血液的成分有哪些？血红蛋白主要存在于哪里？2、如何去除血浆获得红细胞溶液？怎样才能释放其中的血红蛋白？3、如何从破裂红细胞释放的混合物中分离出血红蛋白？4、透析的目的是什么？5、讨论(1)：在红细胞的洗涤过程中，哪些因素是影响洗涤效果的关键因素？为什么？讨论(2)：以上对于红细胞的操作和处理，属于我们整个蛋白质的提取和分离实验步骤中的哪些步骤？6、利用什么方法进一步纯化血红蛋白？1．2分离纯化血红蛋白的原理和方法1．2．1凝胶色谱柱的制作底塞的制作：1．2．2凝胶色谱柱的装填（阅读P68，完成例题1）【例题分析1】．凝胶色谱

6、技术是六十年代初发展起来的一种快速而由简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是，原因是。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由替代。(3)若选用SephadexG－100，则“G”表示100表示。【讨论】：在凝胶色谱柱装填时，尽量紧密，不得存在气泡的原因是什么？一旦出现气泡，怎样处理？1．

7、2．3样品的加入和洗脱(如右图所示)结合课本内容P68-69，思考：(1)在此过程中，需要几次打开下端的流出口？其目的分别是什么？(2)在进行加样的过程中，我们需要注意什么？(3)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是。1．3鉴定蛋白质纯度的原理与方法——()(1)在测定蛋白质分子量时常用的电泳方法是哪一种？在这样一种电泳过程中，不同蛋白质的分离取决于什么？总结与归纳：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？(请用一定的流程图表示)例题2．下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是………………()A．可采