莱克多巴胺新型免疫荧光猝灭检测技术研究.pdf

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：莱克多巴胺新型免疫荧光猝灭检测技术研究TheDevelopmentofNovelFluorescenceQuenchingTechnologyforDetectingRactopamine作者姓名：史聪颖指导教师姓名及学位、职称：唐勇副研究员学科、专业名称：理学、生物化学与分子生物学论文提交日期：论文答辩日期：2014.6答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的

2、地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学

3、位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：摘要目的：以莱克多巴胺(Rac)为检测对象，建立高灵敏正读的荧光猝灭试纸条技术。方法：将抗Rac单克隆抗体标记在金纳米颗粒(Goldnanoparticles,Au-NPs)上,制备金标抗体猝灭剂(mAb-goldquencher)，然后喷涂于结合垫上。将荧光颗粒直接以BSA封闭，并与Rac完全抗原按比例混合后，喷涂于硝酸纤维素膜(Nitrocellulosemembrane

4、,NC膜)检测线(Testline,T-line)处。封闭后的荧光颗粒喷涂于NC膜上校准线(Calibrationline,C-line)处作为对照。试纸条经一系列的条件优化后用以检测Rac添标磷酸盐缓冲液(PB)、猪尿、猪肉样品，通过荧光摄像仪和ImageJ图像处理软件获得定量的检测数据。同时，本研究对建立的Rac荧光淬灭试纸条的特异性、稳定性、回收率进行了评价。为了建立简便的液相免疫荧光检测系统，本研究将Rac抗原标记到多种不同的荧光纳米颗粒上，将Rac抗体标记到纳米金颗粒上用作金标抗体猝灭剂，根据一定比例以不同

5、的添加方法添加到96孔黑底荧光酶标板中，尝试建立随着Rac竞争物浓度的变化而导致的荧光猝灭效率变化的响应系统。同时对试剂添加顺序，标记用荧光颗粒，标记对象进行了研究，以求得到适合用于免疫学检测的液相免疫荧光检测体系。结果：初步建立了高灵敏正读的Rac免疫荧光淬灭试纸条，该试纸条上T线上的荧光信号强度和样品的Rac浓度呈正相关。试纸条的灵敏度为0.16ng/mL，检测范围为0.16ng/mL-20ng/mL。以该荧光淬灭试纸条检测加标于猪尿、猪肉中到的Rac，批内重现性实验结果显示，该方法回收率在97.2%-106.1

6、%之间，最大相对标准偏差为3.84%。对于批间重现性实验，回收率在89.0–109.1%之间，最大相对标准偏差为6.34%。该试纸条对其他相关竞争物没有交叉反应，具有较强的特异性。该试纸条在室温保存3个月后仍有很良好的稳定性。基于液相荧光能量猝灭体系的免疫学检测技术的研究发现，虽然待测物的加入可明显影响检测体系的荧光淬灭效率，但得到的结果并不如预期的线性曲线，基于抗原抗体反应的液相荧光猝灭体系的免疫学检测技术尚需进一步研究与发展。结论：成功的制备了检测Rac的免标记荧光猝灭试纸条，所制备的荧光淬灭试纸条具有检测信号和

7、检测物浓度呈正相关，灵敏度高，操作简便，成本较低等优点，可以作为一种快速有效的检测小分子的手段。关键词：免疫层析试纸条，荧光淬灭，莱克多巴胺，液相荧光猝灭体系IAbstractObjective:Afluorescencepolymerdotslabel-freepositivereadoutandsensitivelateralflowassay(LFA)basedonfluorescencequenchinghasbeendevelopedforthedetectionofRactopamine(Rac),aty

8、peofchemicalresidueinfoodharmfultohumanhealth.AndIt`sthefirsttimeforourlabtostudythedetectionmethodofliquidFRETbasedsystem.Methods:Anti-Racmonoclonalantibodywaslabeledwithgo