western blot实验流程(自己整理).pdf

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1、WesternBlot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysisbuffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1mlPBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；73.每10cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定3.蛋白定量对照样本1样本2200ul工作液+100ulH2O200ul工作液+99ul200ul工作液+99ulH2O+1ul蛋白裂解液H2O+

2、1ul蛋白裂解液200ul工作液+100ulH2O200ul工作液+99ul200ul工作液+99ulH2O+1ul蛋白裂解液H2O+1ul蛋白裂解液测OD值蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率4.计算样品体积10孔15孔Lysate20ul12ullysisbuffer5Xloading5ul3ultotal25ul15ul总蛋白量35ug20ug总体积≤30ul≤20ul5.蛋白变性100℃，5min；提前预热。中间打开盖子1~2次。6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻

3、璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3小时。电泳时间根据具体情况定。7.转膜（250mA，1h30min

4、）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1.电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC膜与胶，NC膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。2.转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。3.转膜选择恒

5、流，每个转印槽建议电流为150-300mA,时间依据胶的浓度适当调整。8.丽春红染色转膜结束后，先用笔标记marker，再将NC膜置于丽春红染色液中，室温5-10分钟即可见红色条带，用洗涤缓冲液洗数次可洗掉红色条带进行后续实验。拍照。根据marker剪膜。9.封闭用5%的牛奶（5g脱脂奶粉溶解于100mlTris-PM中）室温封闭1h；10.一抗孵育按说明书稀释一抗，加入稀释好的一抗，室温孵育2h或4℃过夜；孵育结束后，回收一抗。11.洗膜洗膜液洗4次，每次10min。12.二抗孵育二抗1:10000；eg.5mlTris-PM+0.5ul

6、二抗。摇床孵育1h。13.洗膜洗膜液洗4次，每次10min。14.曝光A液和B液等体积混合。15.数据分析