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1、Westernblot一.仪器及器皿：棕色广口瓶5个(50ml)，灭菌，烧杯3个灭菌，EP管，枪及枪头，分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0.9%生理盐水，冰，灭菌水(1000ml)，两套灭菌器械。二.药品配制：1.TBS×10(TrisBufferedSaline)：2.42gTrisbase8gNaCl100mlH2O,用HCl调pH7.6，4°C保存.(配TBST用)TBST=TBS+0.05%Tween2．TBS：0.303gTrisbase0.4383gNaCl(150mM)0.05gSDS用HCl
2、调pH至8.0(配裂解液用)，50ml约用2.1mlHCl。3．0.5MTris-HCl(pH6.8),50ml,:3gTris-base加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml），定容至50ml，4℃保存。(若调小了，用5.6%NaHCO3调回)。1.5MTris-HCl(pH8.8),50ml,9.08gTris-base加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8（约用2ml），定容至50ml，4℃保存。4．5×RunningbufferpH8.3,500ml：Tris-base7.5
3、g,Glycine(甘氨酸)36g,SDS2.5g加灭菌水至500ml,4℃保存,用时若有沉淀析出可提前拿出置37℃，不用调pH值，用时按1：5稀释，即60ml的5×Runningbuffer加入240ml水。5．30%acrylamide(丙稀酰胺贮液)：8.76gacrylamide,0.24gN,N'-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许灭菌H2O搅匀，最后定容至30ml。用0.45µm的过滤器过滤后4°C避光保存6．10%SDS：5gSDS+50mlH2O,(难溶，需较
4、长时间)，常温保存。7.10%APS(ammoniumpersulfate，过硫酸铵(粉剂也保存在4°C)：100mgAPS+1mlH2O,EP管中即可，4°C保存1周，-20°C保存1个月，时间长了胶难凝。.8.0.1%bromophenolbluedye溴酚蓝10ml溴酚蓝10mg加ddH2O至10ml，搅匀溶解，过滤除去未溶颗粒。9.2×Samplebuffer(1:1)避光保存10%SDS(1g/10ml)400μl0.5MTris(pH6.8)(0.6055g/10ml)250μl100%Glycerol
5、(甘油，丙三醇)200μl2-mercaptoethanol(巯基乙醇)100μl0.1%bromophenolblue(10mg/10ml)80μl总计1030μl避光4°C保存。4×Samplebuffer(1:1)避光保存：10.胶StainSolution(蛋白染液):100mgCoomassieBrilliantBlueG250(考马斯亮蓝)溶于50ml95%的乙醇，加入100ml85%的H3PO4,及50mlddH2O,4°C保存于棕色瓶中。CoomassieBrilliantBlueR250(考马斯亮
6、蓝-R250)：R2500.5g甲醇225ml→定容至500ml冰醋酸50ml11.胶DestainSolution(脱色液)forCoomassieBrilliantBlue：aceticacid(冰乙酸)100mlmethanol(甲醇)100ml加水至1000ml.若转完膜后染色则不用10及11，改用12和13。12.NC膜染色液：0.1%氨基黑染液：氨基黑0.2gmethanol(甲醇)90ml冰醋酸20ml加水至200ml.13．NC膜脱色液：methanol(甲醇)180ml冰醋酸4ml加水至200ml
7、.14．配转膜液(transferbuffer)：Tris6.06gGlycine28.8gMethanol(甲醇)400mlDDH2Oto2000ml，混匀后不用调pH值，4℃保存。(提前将前两种配成800ml，为2×transferbuffer转膜时取400ml加入400mlH2O，另加200mlMethanol(甲醇)即可)。注：所用水最好为灭菌的去离子水便于长期保存。15.Tris-Gly电泳缓冲液（5X）Tris15.1gGly72.0gSDS5.0g去离子水定容至1L，室温保存三实验步骤.(一)提取蛋白
8、并测蛋白浓度：1．开离心机，4°C；2.配裂解液：1mlTBS(pH至8.0)加入10μlNP-40,1μlPepstatin(1μg/ml),胃蛋白酶抑制剂A，溶于DMSO（二甲基亚枫），-20°C保存1μlLeupeptin(1μg/ml),亮抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,-20°C保存1μlAprotinin(1μg/ml),抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,
