肝糖原的提取、鉴定和定量实验报告

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1、生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3、正确操作使用刻度吸管和可调

2、微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。二、实验原理1、肝糖原的提取与鉴定糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡

3、萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。  CuSO4十2NaOH = Na2SO4+Cu(OH)2↓  2Cu(OH)2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O  2CuOH = Cu2O↓(红色)+H2O  Cu(OH)2= CuO↓(黑色)+H2O2、肝糖原定量测定糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理

4、的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先臵于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意1、材料：（1）样品：鸡肝（2）试剂：95%乙醇、5%（W/V）三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L（50%）NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L（30%）KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）、蒽酮显色剂（3）仪器和器材：普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心

5、管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管（2ml、5ml）、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板2、方法：（1）肝糖原的提取与鉴定混匀糖原水解液呈色对比+50%NaOH5滴+浓HCL5滴沸水浴15min，冷却加碘试剂2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴沸水浴2min，溶解沉淀沉淀（弃去）鸡肝约1g，剪碎+5%CCl3COOH1ml研磨至乳状+5%CCl3COOH3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3min（4000r/min）上清液（取2ml）离心5min（4000r/min）+2ml95%乙醇，混匀，静置10min

6、沉淀上清液（弃去）白瓷板孔穴中糖原溶液1ml糖原水解液2滴+班氏试剂4滴沸水浴2min，观察变化（2）肝糖原定量测定+30%KOH1.5ml（用吸量管）在分光光度计620mm波长处，用空白管溶液调零，测定并记录各管溶液的吸光度（A）沸水浴10min，冷却往空白管中加入蒸馏水1.0ml，标准管中加入标准葡萄糖溶液1.0ml，样品管中加入糖原提取液1.0ml加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液冷却，全部转入100ml容量瓶中取鸡肝0.15g于试管中沸水浴15min取3支试管，分别标记为空白管、标准管、样品管往三支试管中分别加入0.2%蒽酮溶液

7、2.5ml，混匀四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、结果：（1）实验现象：1）肝糖原的提取与鉴定第一次离心后，肝匀浆分为2层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀。图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。第二次离心后，溶液分为2层，上层为上清液，试管底部有少量白色沉淀。图3第二次离心后的白色沉淀④加入蒸馏水并沸水浴后，白色沉淀溶解。⑤白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别。碘试剂2滴糖原溶液2滴

8、碘试剂2滴图4呈色对比结果（左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂）⑥往糖原水解液中加入班氏试剂后，溶液呈蓝色（班氏试剂本身为蓝色）。沸水浴后，溶液变为砖红色（生成砖红色沉淀）。砖红色沉淀图5糖原水