肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告.doc

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1、肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蕙酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计。二、实验原理1、

2、肝糖原的提取与鉴定糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。CuS04十2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)2I2Cu(OH)2十C6H12O6=2CuOH十氧化型葡萄糖+

3、H202CuOH=Cu20I(红色)+H20Cu(0H)2=CuOl(黑色)+H202、肝糖原定量测定糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物一一5-羟甲基吠喃甲醛，此化合物再与蕙酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先常于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意1、材料

4、：(1)样品：鸡肝（2）试剂:95%乙醇、5%（W/V）三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L（50%）NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L（30%）KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）、酮显色剂（3）仪器和器材：普通离心机、室温-100°C恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镶子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管（2ml、5ml）、1000uI微量可调取液器、：LOOml容量瓶、白瓷反应板2、方法：（1）肝糖原的提取与鉴定（2）肝糖原定量测定四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻

5、辑推论，并得出结论。1>结果：（1）实验现象：1）肝糖原的提取与鉴定?第一次离心后，肝匀浆分为2层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀。图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后?加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。?第二次离心后，溶液分为2层，上层为上清液，试管底部有少量白图3第二次离心后的白色沉淀%1加入蒸馅水并沸水浴后，白色沉淀溶解。%1白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别。碘试剂2滴糖原溶液2滴碘试剂2滴图4呈色对比结果（左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂）%1往糖原水解液中加入班氏试剂后，溶液呈蓝色（班氏试剂

6、本身为蓝色）。沸水浴后，溶液变为砖红色（生成砖红色沉淀）。砖红色沉淀图5糖原水解液图6沸水浴前图7沸水浴后2）肝糖原定量测定?往鸡肝中加入KOH并沸水浴后，溶液变为红棕色。图8沸水浴后，溶液变为红棕色?水浴前，空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色（颜色比空白管浅）。水浴后，空白管无明显变化，标准管颜色略变深，样品管由黄色变为深绿色（颜色比标准管深）。空白管标准管样品管空白管标准管样品管图9水浴前图10水浴后（2）实验数据:测定次数123平均值标准管0.5930.5930.5940.593样品管0.4010.3970.3960.398表1标准管和样品管测得的吸光度（A

7、620）及平均值按下式计算样品中肝糖原的含量：A样品肝糖原（g/100g肝组织）=A标准由于样品稀释了一倍，因此计算结果需乘二。结果：肝糖原的含量为4.966g/100g肝组织。故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。2、讨论：（1）实验数据分析:本次实验测得肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝肝糖原含量为2勺g/100g肝组织。本次实验结果偏大，说明肝组织中含有过多肝糖原，试验所用鸡肝为脂肪肝。*0.05*肝组织重（g）100*1000100（2）呈色对比结果分析：糖原溶液