wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和标记

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1、Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和标记赵科研柳克祥侯明晓孙江滨吴慧颖李博【摘要】  目的建立SCs)分离、培养的方法,并进行鉴定、标记。方法采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征;流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率;电镜检查第3代MSCs超微结构。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果原代培养的MSCs于6~8h后贴壁,6d左右形成集落,14d左右可达到80%~90%融合。第3代细胞表面标记物

2、CD29,CD44,CD34和CD45的阳性率分别为98.6%,78.2%,0.0%,0.3%。超微结构清晰,可见细胞器,如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体,细胞核呈圆形或不规则,可见较多微绒毛。DAPI可良好标记MSCs细胞核,呈蓝色荧光。结论采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs,在第3代可获得高纯度MSCs。DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs。【关键词】细胞培养;间充质干细胞;种子细胞;示踪剂【Abstract】ObjectiveToestablishamethodforisolat

3、ionandcultureofbonemarroesenchymalstemcells(MSCs)fromethodsMSCsthebonemarroethod.ThemorphologyofMSCsicroscope.TheexpressionofCD29,CD44,CD34andCD45ofthethirdgenerationcellsetry.Electronmicroscopicfeaturesaryculture,MSCsadheredtoplasticsurfaceoftheculturedish.

4、 About6dlater,thecellsproliferatedincolonies.PrimaryMSCsreached80%~90%ofconfluencein14dapproximately.ThepositiveratesofCD29,CD44,CD34,andCD45inMSCsatthirdgenerationicroscopeMSCshadplentifulcytoplasmitochondriaroughendoplasmicreticulaandGolgiplexes.Theirnucle

5、iicrovillionthesurface.AlloftheMSCsafterlabelingbyDAPIshoalstemcellscanbesuccessfullyisolatedandcultivatedbyadherentmethod.AndhigherpurityMSCscanbepickedupaftercultureexpansionatP3.DAPIcanbeaneffectivetraceragenttolabelMSCs.【Keyalstemcells;Seedcells;Tracerag

6、ent  骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞,可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、干细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞分化〔1,2〕,具有高度可塑性,易于体外扩增,因其来源充足、取材方便,体外增殖能力相对较强,而且在异体移植中排斥反应小,被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞,为心血管疾病、神经疾病和骨关节疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案。本文在总结贴壁分离法培养MSCs的基础上,优化MSCs纯化、鉴定、标记的方法,以获得稳定的

7、培养体系,为应用组织工程技术提供大量的种子细胞。  1材料与方法  1.1动物  清洁级雄性EM培养基(Gibco公司),特级胎牛血清(Gibco公司),胰酶(Sigma公司),亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29AlexaFluor(Biolegend公司),小鼠抗大鼠CD45过氧化物酶(FITC)(Biolegend公司),小鼠抗大鼠CD44PE(SantaCruz公司),小鼠抗大鼠CD34FITC(SantaCruz公司),46二脒基2苯基吲哚(DAPI)储存液(Sigma公司)。  1.3分离和培养

8、  EM冲洗骨髓腔,取混悬液,1000r/min离心10min,弃上清液,沉淀含10%胎牛血清的DMEM混悬,将获得的细胞接种在100ml培养瓶中,5%CO2,37℃下培养24~48h,换液,去除未贴壁细胞,2~3d更换一次培养基,光镜观察细胞融合情况,细胞80%融合后传代,0.25%胰酶消化,用血球计数仪计数细胞、传代,培养3~5代细胞。  1.4透射电镜样品制备  将培养3代10c

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